Funktion von a/eIF2 in post-transkriptioneller Regulation

Der zellbiologisch grundlegende Prozeß der Protein Biosynthese ist in der Domäne der Archaea bislang wenig erforscht. Um evolutionäre Aspeckte der Proteinbiosynthese zu studieren, haben wir begonnen die Mechanismen und Funktionen der translationalen Initiationsfaktoren des Modelorganismus für den crenarchaellen Zweig der Archaea, Sulfolobus solfataricus, zu analysieren. Der Schwerpunkt lag hierbei bei dem eukaryontischen Ortholog a/eIF2. Wir konnten zeigen, dass a/eIF2 für die Bindung von Initiator-tRNA an das Ribosom notwendig ist, wobei der archaelle Faktor einige Unterschiede zu dem eukaryontischen Ortholog zeigte. Interessanterweise weißt a/eIF2, im speziellen die a/eIF2 -Unterheit, eine weitere Funktion mit Analogie zum eukaryotischen Cap-complex auf. Der Faktor bindet an das triphosphorylierte 5`-Ende von mRNAs und schützt das 5`-Ende der mRNA vor dem Abbau. Diese Funktion von a/eIF2 soll in den projektierten Arbeiten im Hinblick auf (i) die extremen Lebensbedingungen von S. Solfataricus, (ii) mögliche Interaktionspartner von a/eIF2, (iii) den RNA Metabolimus von S. Solfataricus, (iv) die Konsevierung dieser Funktion in verschiedenen Archaea und (v) die drei-dimensionale Struktur von a/eIF2 - tRNAi und a/eIF2-RNA Komplexen untersucht werden. (i) Um unsere bisherigen Erkenntnisse zu verifizieren soll mittels genetischer und immunologischer Methoden untersucht werden, ob eine Korrelation zwischen unterschiedlichen Konzentrationen von a/eIF2 bzw. von a/eIF2 unter verschiedenen Wachstums- und Stressbedingungen und der mRNA Stabilität besteht. Weiters soll mittels DNA "microarrays" getestet werden, ob a/eIF2 bzw. a/eIF2 eine Subklasse von mRNAs bevorzugt stabilisiert. (ii) Da a/eIF2 bzw. a/eIF2 die Translation von leaderless mRNAs inhibitiert, stellt sich die Frage, wie die betreffenden mRNAs recycliert werden können um wieder für die Translation zur Verfügung zu stehen. Mit Hilfe von immunologischen, biochemischen und biophysikalischen Methoden soll versucht werden mögliche a/eIF2 Protein-Interaktionspartner zu identifizieren bzw. a/eIF2() auf mögliche Modifizierungen hin zu untersuchen. (iii) Der mRNA Abbau ist in Archaea, mit Ausnahme des 3` 5` Abbau durch das Exosom, kaum untersucht. Da wir zeigen konnten, dass a/eIF2 dem 5` 3` direktionalen Abbau entgegenwirkt, soll versucht werden das beteiligte RNase Enzym(e) zu identifizieren. Dazu sollen Fraktionen von S. Solfataricus Proteinen in "in-Gel assays" auf mögliche RNase Aktivität untersucht werden. RNase Kanditatenproteine sollen anschließend mittels Massenspektrometrie identifiziert werden. (iv) Basierend auf den bekannten Genomsequenzen von nahen Verwandten von S. Solfataricus bzw. von Euryarchaeota, wollen wir die Aktivität von a/eIF2 Homologen im Hinblick auf die Bindung an das 5`-Ende von mRNAs untersuchen. Diese Studien sollten eine Aussage hinsichtlich der evolutionären Koservierung der mRNA Schutzfunktion von a/eIF2 in verschiedenen Archaea ermöglichen. (v) Unsere Studien haben gezeigt, dass die Bindung von a/eIF2() an entweder Initiator-tRNA oder das 5`-Ende von mRNAs erfolgt. Diese Studien erlaubten keine Aussage darüber, ob die Bindungsdomänen der beiden Liganden überlappen, oder ob die Bindung an mRNAs zu strukturellen Änderungen führt, die eine Bindung an Initiator- tRNA verhindern. Gemeinsam mit unserem langjährigen Kollaborationspartner Dr. M. Garber, Institute of Protein Research, Pushchino, Russia soll daher die Röntgenstruktur von a/eIF2 im Komplex mit Initiator-tRNA und dem 5`-Ende einer mRNA ermittelt werden.

Post-transkriptionale Kontrollmechanismen der Genregulation sind weitgehend unverstanden in Archaea. In einem vorangehenden Projekt analysierten wir die Funktionen von translationalen Initiationsfaktoren in dem Modellcrenarchaeon Sulfolobus solfataricus (Sso), insbesondere die des trimeren Initiationsfaktors aIF2. Dieser Faktor wird einerseits für die Bindung der Met-tRNAMet an das Ribosom benötigt, andererseits konnten wir zeigen, dass der Proteinkomplex mit Hilfe der ?-Untereinheit an das 5Triphosphat Ende von RNAs bindet und diese vor Degradierung schützt. Diese Funktion von aIF2 weist Analogie zu der des cap-Komplexes bei Eukaryonten auf.Da in Crenarchaeota bisher keine Ribonukleasen mit 5 > 3 Aktivität beschrieben waren, wurde im ersten Teil des Projekts nach RNasen gesucht, de diese Funktion haben. Mit Hilfe von Zymogram assays und bioinformatischen Analysen wurde ein Kandidatenenzym gefunden. Die weitere biochemische Analyse verifizierte dessen 5> 3 Aktivität und ergab, dass für die Aktivität der Phosphorylierungsstatus des 5 Endes der RNA von Relevanz ist. Die RNase weist typische Motive der ß-CASP Familie der ß-metallo-ß-Laktamasen auf und wurde daher Sso-RNase-J genannt. Sie wurde mittlerweile in die Subgruppe der aCSPF2 Proteine eingeordnet. Wir konnten zeigen, dass die Bindung von aIF2-? an das 5 Ende der RNA der aCSPF2 Aktivität entgegenwirkt. Diese Studie zeigte erstmals experimentell, dass Ribonukleasen mit 5> 3Aktivität in Crenarchaeota vorkommen. Da Sulfolobus acidocaldarius (Saci) genetisch einfacher manipuliert werden kann als Sso, wurde die biologische Signifikanz von aCSPF2 mit Hilfe des homologen Saci Enzyms untersucht. Biochemische Untersuchungen mit rekombinantem Saci-aCSPF2 Enzym ergaben, dass es die gleiche enzymatische Aktivität wie Sso-aCSPF2 besitzt. Anschließend wurde eine Deletionsmutante in dem Saci-aCSPF2 Gen hergestellt und dessen Einfluss auf das Transkriptom mit Hilfe von RNAseq untersucht. Diese Analyse deckte 560 mRNAs mit unterschiedlicher Abundanz auf, was für eine beträchtliche Rolle für aCSPF2 im RNA Metabolismus spricht. Zusätzliche bioinformatische Analysen zeigten Transkripte auf, die bevorzugt am 5Ende degradiert waren. Dies konnte exemplarisch für zwei Transkripte experimentell verifiziert werden. Diese Studie zeigte erstmals, dass aCSPF2 Enzyme tatsächlich eine Rolle im 5> 3Abbau von mRNA in Crenarchaeota spielen.Unsere Hpothese zur Funktion von aIF2 beinhaltet, dass aIF2 unter Bedingungen, die kein Wachstum ermöglichen, an das 5 Ende von mRNAs bindet und diese vor Abbau schützt. Ebenso vermuteten wir, dass aIF2 von mRNAs entfernt wird, wenn der Nahrungsstress aufgehoben ist, d.h. eine erneute Translation der geschützten mRNAs sattfindet. Wir konnten zeigen, dass eine Überexpression von aIF2-? zur Wachstumshemmung führt, die dadurch erklärt werden kann, dass die Bindung des Faktors die Translation von häufig vorkommenden leaderless mRNAs inhibiert. Wir untersuchten daher den Mechanismus, der zur Ablösung von aIF2 vom 5 Ende von RNAs führt. Wir konnten ein Protein identifizieren, das während erneutem Wachstum nach einer längeren Hungerungsphase mit aIF2 assoziiert. Wir konnten zeigen, dass das Protein an die aIF2-? Untereinheit bindet und zur Ablösung des Faktors vom 5 Ende von RNA führt. Die biologische Signifikanz des Proteins zeigte sich darin, dass eine Deletionsmutante im entsprechenden Gen eine herabgesetzte Proteinsynthese während erneutem Wachstum nach Hungerung aufwies. Das Protein wurde daher Trf (Translation recovery factor) benannt. Der einzigartige RNA Protektions / Recyling Mechanismus weist funktionelle Analogie zur mRNA Speicherung in Eukaryonten auf.