Gezielte moduläre Transduktion mit retroviralen Vektoren

Auf Retroviren basierende gentherapeutische Vektoren (retrovirale Vektoren, RVs) gelten als vielversprechende Therapiemöglichkeit, nicht nur für monogenische Defekte wie X-linked Severe Immunodeficiency (X-SCID) oder Chronic Granulomatous Disease (CGD), sondern auch für Krebs. Eine wichtige Voraussetzung zur Anwendung von RVs in Patienten, speziell nach systemischer Administration, ist die Möglichkeit, genau definierte Zelltypen gezielt zu transduzieren beziehungsweise zu infizieren. Der Infektionstropismus von Retroviren wird von dem Hüllglykoproteinkomplex (Env) bestehend aus Oberflächen- (SU) und Transmembranprotein (TM) bestimmt: SU sorgt für die Bindung an die Rezeptoren auf Zielzellen und TM ist für die Fusion von Virus und Zielzelle verantwortlich. Die gezielte Infektion gewünschter Zielzellen bedeutet deswegen meist eine Modifikationen der Env-Proteine, wobei diese Modifikationen im Allgemeinen zu reduzierter Infektionseffizienz führen. Um dieses Problem zu umgehen, werden nun in einem relativ neuen Ansatz Bindungs- und Fusionsfunktionen unter Einsatz von bindungsunabhängigen Fusionsproteinen von separaten Molekülen bereitgestellt. Dazu können, unter anderem, mutierte Varianten von Sindbis- oder Influenza-Virusglykoproteinen (SINmu, beziehungsweise HAmu) verwendet werden. Zusätzlich soll ein auf dem retroviralen TM basierendes System getestet werden, das biologisch mehr an die natürliche retrovirale Infektion angelehnt ist. Bindungsproteine sollen dann über den Prozess des viralen Paintings mittels glykosylphosphatidylinositol (GPI)-verankerter Proteine auf fertig gereifte Viruspartikel übertragen werden. Die Kombination von bindungsunabhängigen Fusogenen und viralem Painting mit Bindungsfaktoren liefert ein moduläres System zur zielgerichteten Infektion - dieselben RV können mit verschiedensten Bindungsfaktoren ausgestattet und auf verschiedenste Zielzellen gerichtet werden. Als Bindungsfaktoren verwendet werden sollen Wachstumsfaktoren wie der epidermale Wachstumsfaktor (EGF) oder der vaskuläre Endothelwachstumsfaktor (VEGF), der zelluläre Rezeptor für HIV, CD4 - und das Biotin bindende Streptavidin. Proof-of-principle kann dann demonstriert werden, indem vielfach höhere Infektionsraten in Zellen, die mit dem jeweiligen Rezeptor transfiziert wurden, im Vergleich zu untransfizierten Zellen erreicht werden können. Wir glauben, dass dieses Projekt sowohl zum Verständnis der ersten Schritte der retroviralen Infektion beitragen kann als auch einen neuen Ansatz zur zielgerichteten retroviralen Transduktion liefern kann.

Das Projekt Gezielte Moduläre Transduktion Mit Retroviralen Vektoren wurde über eine Laufzeit von 40 Monaten durchgeführt. Hauptziel war die Entwicklung einer neuen Strategie zur selektiven Infektion ausgewählter Zelltypen mittels Veränderung der viralen Bindungseigenschaften. Ein zweites, unabhängiges System würde dann die Aufnahme in die Zellen gewährleisten. Fokus des Projektes waren an HIV angelehnte Gentherapievektoren. Aufgrund der hohen Infektionseffizienz und der Fähigkeit auch nicht-teilende Zellen zu infizieren liefern diese wichtige Grundvoraussetzungen für eine erfolgreichen Gentherapie. Wir entwickelten eine Reihe von Bindungsfaktoren die mit biologischen fett-ähnlichen Ankerstrukturen versehen wurden, den Glycosylphosphatidylinositol- oder GPI-Ankern. Die Anheftung dieser Faktoren an Virusoberflächen mittels der GPI-Anker in einem Molecular Painting (MP) genannten Prozess wurde untersucht. Der Proteintransfer war erfolgreich und die Funktionen der Proteine blieben in den meisten Fällen erhalten. Im Einklang mit früheren Versuchen zu zielgerichteter Infektion, stellte die Aufnahme der Viren in die Zelle die größte Schwierigkeit dar. Wir verwendeten ein mutiertes, bindungsunfähiges Protein des Sindbis-Virus, das sich in früheren Studien in ähnlichen Situationen als effektiv herausgestellt hatte. Schlussendlich wurde die Veränderung des viralen Bindungs- bzw. Infektionsverhaltens unter Verwendung von Zellen untersucht, welche die geeigneten Rezeptoren tragen. Erste Versuche zeigten, dass Veränderungen in der Anheftung von Viren an Zellen mittels fluoreszierender Marker nachweisbar sind. Diese Versuche werden nun mit den geeigneten Bindungssystemen wiederholt.