Bioaktivierung von Nitroglycerin durch ALDH2

Nitroglycerin (Glyceroltrinitrat, GTN) wird seit mehr als 130 Jahren zur Therapie der Koronaren Herzkrankheit eingesetzt. Die klinische Wirkung von GTN und anderen organischen Nitraten beruht auf der Erweiterung von großen Blutgefäßen (Koronararterien, venöse Kapazitätsgefäße), was zu einer Verbesserung der Durchblutung des Herzens und einer Verminderung der kardialen Vorlast führt. GTN ist eine Prodrug, die in Gefäßmuskelzellen enzymatisch bioaktiviert wird, wobei Stickstoffmonoxid (NO) entsteht, das durch Aktivierung löslicher Guanylatcyclase (sGC) cGMP-vermittelte Vasodilatation auslöst. Das Schlüsselenzym der GTN-Bioaktivierung ist mitochondriale Aldehyd-Dehydrogenase (ALDH2). Kontinuierliche Behandlung von Blutgefäßen mit GTN führt zur oxidativen Inaktivierung von ALDH2, was möglicherweise die Entwicklung vaskulärer Nitrattoleranz erklärt, d.h. den Verlust der therapeutischen Wirkung von GTN nach längerfristiger Applikation. Es ist gut dokumentiert, dass ALDH2 Denitrierung von GTN zu 1,2-Glyceroldinitrat und anorganischem Nitrit katalysiert. Allerdings blieb es lange unklar wie diese metabolische Reaktion mit der Bioaktivierung von GTN, d.h. der Aktivierung von sGC, gekoppelt sein könnte. Kürzlich haben wir entdeckt, dass ALDH2 die direkte Reduktion von GTN zu NO katalysiert und identifizierten ein Mutante des Enzyms (E268Q) die Hyperaktivität bezüglich GTN-Bioaktivierung (sGC-Aktivierung) zeigte, obwohl die klassischen Enzymaktivitäten, einschließlich der Denitrierung von GTN zu 1,2-Glyceroldinitrat und Nitrit, verloren gingen. Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass ALDH2 GTN-Biotransformation durch zwei unabhängige Reaktionen katalysiert: metabolische 2-Elektronen- Reduktion zu Nitrit und 3-Elektronen-Reduktion zu NO. Es ist das Ziel des vorliegenden Projekts, die molekularen Mechanismen dieser beiden Wege der GTN- Biotransformation aufzuklären und die in vivo-Relevanz der NO-Bildung zu untersuchen. Wir werden die dreidimensionalen Strukturen von Wildtyp-ALDH2 und ausgewählten Mutanten des Proteins in Anwesenheit von gebundenem GTN lösen, um essentielle Aminosäurereste im aktiven Zentrum zu identifizieren, auf Interferenz der klassischen GTN-Denitrierung mit der NO-Bildung prüfen, um die beobachtete Hyperaktivität der E268Q-Mutante zu erklären, und die molekularen Konsequenzen der Enzym-Inaktivierung durch GTN sowie mögliche Reaktivierungs-Wege untersuchen. Die in vivo-Relevanz der NO-Bildung soll durch Messung des vasodilatierenden Effekts von GTN und der Entwicklung von Nitrat-Toleranz in ALDH2-defizienten Mäusen mit gefäßmuskel-spezifischer Überexpression der E268Q-Mutante geklärt werden. Die geplanten Untersuchungen werden zu einem besseren Verständnis der molekularen Mechanismen der Bioaktivierung von GTN und der Entwicklung vaskulärer Nitrat-Toleranz beitragen.

Nitroglycerin (Glyceroltrinitrat, GTN) wird seit mehr als 130 Jahren zur Therapie der Koronaren Herzkrankheit eingesetzt. Die klinische Wirkung von GTN und anderen organischen Nitraten beruht auf der Erweiterung von Blutgefäßen, vor allem Koronararterien und venösen Kapazitätsgefäßen, was zu verbesserter Durchblutung des Herzens und Verminderung der kardialen Vorlast führt. Die biologische Wirkung von GTN erfordert Bioaktivierung des organischen Nitrats durch Aldehyd-Dehydrogenase-2 (ALDH2). Diese enzymatische Reaktion führt zur Bildung von Stickstoffmonoxid (NO) oder einer NO-artigen Verbindung, die über Aktivierung löslicher Guanylatcyclase (sGC) cGMP-vermittelte Vasodilatation bewirkt. Ein zentrales Problem der Nitrattherapie ist der Wirkungsverlust bei länger andauernder Applikation von GTN (Nitrattoleranz). Ein wesentlicher Faktor in der Entstehung von Nitrattoleranz ist vermutlich die Inaktivierung der ALDH2 durch kontinuierlich appliziertes GTN. In diesem Projekt wurden mehrere Mutanten der ALDH2 charakterisiert, die eine direkte Reduktion von GTN zu NO katalysieren. Eine dieser Mutanten ("NO-Mutante") zeigte höhere GTN-Bioaktivierungsktivität (GTN-induzierte Aktivierung von sGC) als das Wildtyp-Enzym, obwohl die etablierten Enzymfunktionen nicht mehr nachweisbar waren. Diese Befunde weisen darauf hin, dass die ALDH2-katalysierte Biotransformation von GTN über zumindest zwei unterschiedliche Wege verläuft: Clearance-basierte 2-Elektronen-Reduktion zu Nitrit und 3-Elektronen-Reduktion zu NO. In Zusammenarbeit mit Karl Gruber (Institut für Molekulare Biowissenschaften, Universität Graz) und Leslie Poole (Wake Forest University, NC, USA) haben wir die dreidimensionale Struktur dieser Mutante mit gebundenem GTN aufgeklärt und Intermediate der ALDH2/GTN-Reaktion mittels Massenspektrometrie identifiziert. Um abzuklären, ob die ALDH2-katalysierte NO-Bildung für die GTN-induzierte Relaxation verantwortlich ist, wurde eine Methode zur Überexpression von ALDH2 in ALDH2-defizienten Blutgefäßen von Knockout-Mäusen etabliert. Obwohl die Expression der NO-Mutante bisher nicht erfolgreich war, zeigte die Überexpression des Wildtyp-Enzyms, dass für die GTN-induzierte Relaxation ALDH2 im Zytosol der Zellen vorliegen muss. Dieses überraschende Ergebnis widerlegt die derzeitige Lehrmeinung, wonach die vaskuläre Bioaktivierung von Nitroglycerin in Mitochondrien stattfindet.Die im Rahmen des Projekts erhaltenen Ergebnisse liefern neue Erkenntnisse über die zellulären und molekularen Mechanismen der Bioaktivierung von Nitroglycerin in Blutgefäßen und könnten zur Entwicklung neuer Koronartherapeutika führen, die keine Nitrattoleranz erzeugen.