Ein neuer Ansatz zur Identifizierung von PP2A Substraten

Proteinphosphatase 2A (PP2A) ist ein Paradebeispiel für die Enzymfamilie der Serin/Threonin-Phosphatasen und deren Enzymarchitektur, nämlich den Aufbau aus verschiedenen Untereinheiten. PP2A besteht in vivo aus über 70 verschiedenen heterotrimeren Holoenzymen, wovon jedes aus einer katalytischen C Untereinheit, einer regulatorischen A Untereinheit und einer von mehreren regulatorischen B Untereinheiten zusammengesetzt ist. Die B Untereinheiten sind für die Substratspezifität und intrazelluläre Lokalisation von PP2A Holoenzymen verantwortlich. Aus der großen Anzahl verschieden zusammengesetzter PP2A Holoenzyme läßt sich vorhersagen, dass es mindestens ebenso viele PP2A Substrate in der Zelle geben sollte. In der Tat zeigen genetische Studien in Hefe und Studien in Säugertierzellen mit PP2A Inhibitoren, dass PP2A Holoenzyme viele verschiedene zelluläre Prozesse regulieren, was wiederum auf die Existenz vieler verschiedener intrazellulärer PP2A Substrate hinweist. Die Identifizierung dieser Substrate hat sich jedoch als schwierig erwiesen, da es mit den derzeitigen Methoden unmöglich ist, die transiente Interaktion zwischen PP2A Enzym und Substraten während der Katalyse zu detektieren. Wesentliches Ziel des geplanten Projekts ist es daher, M-TRACKing für die Identifizierung des transienten PP2A- Interaktoms in Hefe zu adaptieren und optimieren. M-TRACKing ist ein neuartiges "Two-Hybrid" System, das auf einem Konzept von G. Ammerer (Universität Wien), K. Nasmyth and T. Jenuwein (ehemals IMP, Wien) beruht und von G. Ammerers Labor für die Detektion von Protein-Interaktionen des HOG-Stress- Signalübertragungsweges entwickelt wurde. M-TRACKing besitzt gegenüber existierenden "Two-Hybrid" Systemen den Vorteil, dass ein Interaktionspartner durch eine enzymkatalysierte Protein-Modifikation markiert wird, die mit der bekannten Spezifität, Effizienz und Geschwindigkeit einer Enzymreaktion übetragen wird. Da eine Interaktion durch eine enzymkatalysierte Reaktion detektiert wird, nahm ich an, dass es mit M-TRACKing möglich sein sollte auch PP2A Substrate zu identifizieren, die üblicherweise nur transient mit PP2A interagieren und deshalb mit heute existierenden Methoden nicht identifiziert werden können. Unsere vorläufigen Ergebnisse zeigen, dass mit M-TRACKing eine transiente PP2A-Substrat Interaktion detektiert werden kann. Daher planen wir - ausgehend von unseren präliminieren Daten - M-TRACKing experimentell für die Detektion solcher kurzlebigen Interaktionen zu optimieren. Als komplementäre Strategie zur Beschleunigung des M-TRACKing (=Detektions-) Vorgangs werden wir die PP2A Katalyse in vivo verlangsamen, indem wir Wildtyp PP2A durch PP2A Mutanten mit verminderter Aktivität ersetzen. Das optimierte M-TRACKing System werden wir in einem Proteom-weiten Screen zur Identifizierung von PP2A Substraten einsetzen. Die Resultate des geplanten Projekts sollen uns einen Einblick in PP2A-regulierte Prozesse ermöglichen und zugleich den Beweis für M-TRACKing als Methode der Wahl zur Identifizierung transienter Interaktionen in vivo erbringen.

Proteine sind Hauptbestandteile einer Zelle und üben ihre Funktion durch die physische Interaktion mit anderen Proteinen und Zellbestandteilen aus. Die Identifizierung des gesamten Interaktionsnetzwerks ist eine unabdingbare Voraussetzung für die Aufklärung der molekularen Mechanismen, die den in den Zellen ablaufenden Prozessen zugrunde liegen. Viele dieser Interaktionen sind sehr kurzlebig, zum Beispiel jene zwischen Enzymen und deren Substraten. Diese Interaktionen waren mit den zu Beginn des Projekts vorhandenen Methoden sehr schwierig bis gar nicht nachzuweisen, und aus diesem Grund war das Wissen über Substrate von Enzymen sehr beschränkt. Das traf auch auf die Proteinphosphatase 2A (PP2A) zu, einer Enzymfamilie, die die Dephosphorylierung von Substraten katalysiert, und deren Biogenese und Regulation wir im Labor studieren. Um die schwarzen Flecken auf der PP2A Interaktionslandkarte zu füllen, schlug ich eine Detektionsmethode vor, die selbst auf einer kurzlebigen Enzym-Substrat Interaktion aufgebaut ist. Wir adaptierten dazu ein "Two-Hybrid" System, das als M-Track (für Methyl-Tracking) bezeichnet wird, indem wir PP2A mit einer Histonlysinmethyltransferase fusionierten und ein potentielles PP2A-Substrat mit dem Substrat der Methyltransferase, dem Histon H3-Peptid. Wie angenommen, konnten wir zum ersten Mal kurzlebige Interaktionen zwischen PP2A und Substraten direkt in vivo nachweisen. Wir konnten auf diese Weise nicht nur direkte von indirekten PP2A Zielproteinen unterscheiden, sondern auch erstmals den Beweis für die Substratspezifität verschiedener PP2A Holoenzyme auf molekularer Ebene erbringen. Wir publizierten unsere Ergebnisse in dem Topjournal Nature Methods und die ErstautorInnen der Studie wurden mit dem Sanofi-Aventispreis der Medizinischen Universität Wien ausgezeichnet. In Folge validierten wir weitere PP2A Substrate und entwickelten darüber hinaus eine Methode, mit der Proteine, die in einem M-Track Assay markiert wurden, in vivo sichtbar gemacht werden können. Weiters konnten wir zeigen, dass die Methylmarkierung auch dazu verwendet werden kann, den Weg eines Proteins durch ein Proteinnetzwerk zu verfolgen. Im Rahmen dieses Projekts ergab sich aber auch ein translationeller Forschungsaspekt. Wir stellten hochspezifische monoklonale Antikörper her, die eine unabdingbare Voraussetzung für die erfolgreiche Anwendung der M-Track Methode waren. Da diese Antikörper auch zur Analyse epigenetischer Modifikationen geeignet sind, konnten wir Lizenzverträge mit 11 internationalen Biotech Firmen abschließen. Mit Hilfe unserer neu etablierten Methode zur Detektion kurzlebiger Proteininteraktionen wird es nun erstmals möglich sein die hierarchische Struktur von Interaktionsnetzwerken aufzuklären, was wiederum zu einem besseren Verständnis von Signalkaskaden führen wird.