Selektive Hemmung von mesenchymalen und hämatopoetischen RANKLs

Receptor activator of NF-B ligand (RANKL) ist nicht nur ein essentielles Zytokin für die Differenzierung, Aktivierung und das Überleben von Osteoklasten, sondern könnte auch in die Pathogenese des akuten Myokardinfarkts (MI) und von Herzversagen involviert sein. Aufgrund der fundamentalen Rolle des RANKL/Osteoprotegerin (OPG)-Systems im Knochen wurden monoklonale Antikörper gegen humanen RANKL (hRANKL) wie Denosumab und AMG161, die IgG1-Version von Denosumab, entwickelt. Darüber hinaus wurden kürzlich hRANKL knock-in (KI)-Mäuse generiert, in denen das Exon 5 im RANKL-Gen gegen die hu-mane Sequenz ersetzt wurde. Dieses chimäre RANKL-Protein kann zum einen die Knochen-resorption in Mäusen induzieren, wird zum anderen jedoch von Denosumab und AMG161 vollständig inhibiert. Noch unpublizierte Studien in meinem Labor haben klar gezeigt, dass bei einer Transplantation mit unfraktioniertem Knochenmark nur hämatopoetische und endotheliale, nicht jedoch mesenchymale Vorläuferzellen transplantiert werden. Das vorlie- gende Projekt basiert auf der Idee, dass - zusammen mit einem anti-hRANKL-Antikörper wie zum Beispiel AMG161 - hRANKL-KI-Mäuse als ein Werkzeug benutzt werden könnten, um zwischen der pathophysiologischen Rolle von RANKL aus hämatopoetischen/endothelialen und mesenchymalen Quellen zu separieren. Um dieses Ziel zu erreichen, schlagen wir vor, Wildtyp (WT)- und hRANKL-KI-Mäuse letal zu bestrahlen und mit Knochenmark von hRANKL-KI bzw. WT-Mäusen zu transplantieren. In bestrahlten WT-Mäusen, die mit Kno-chenmark von homozygoten hRANKL-Donoren rekonstituiert wurden, produzieren alle hämatopoetischen und einige endotheliale Zellen chimären hRANKL, während alle mesenchymalen Zellen murinen RANKL produzieren. Nachdem AMG161 nur humanen, aber nicht murinen RANKL blockt, wird AMG161 in diesem Modell nur chimären RANKL aus hämatopoetischen/endo-thelialen Zellen blocken. Umgekehrt, wenn homozygote hRANKL-KI-Mäuse mit Knochenmark von WT-Mäusen rekonstituiert werden, wird nur RANKL aus mesenchymalen Zellen geblockt. Zusammen mit hRANKL-KI-Mäusen als Kontrolle für eine komplette RANKL-Inhibition könnte ein derartiges System einzigartige Einblicke in die Pa-thophysiologie von Krankheiten ermöglichen, in denen RANKL-Signaling eine Rolle spielt. Dieses Vorhaben ist auf Osteoimmunologie und MI fokussiert und zielt darauf ab, folgende Fragen zu beantworten: 1) Was ist der relative Anteil von RANKL aus mesenchymalen oder Immun-/endothelialen Zellen an der Pathophysiologie von Sexualhormonmangel-induziertem Knochenverlust? 2) Hat eine totale RANKL-Inhibition oder eine selektive Hemmung von RANKL aus hämatopoetischem/endothelialem bzw. mesenchymalen Zellen eine positive Wirkung auf die Heilung von myokardialen Läsionen? Dieses Vorhaben wird das Wissen über die pathophysiologische Rolle von RANKL aus unterschiedlichen Zelltypen bei Osteoporose und MI signifikant erhöhen. Osteoporose und MI sind Hauptursachen für Invalidität und Tod in modernen Gesellschaften mit einem hohen Anteil von älteren Menschen. Unser Vorhaben könnte deshalb wichtige Auswirkungen auf unsere Gesundheitssysteme haben.

Wir haben in diesem Projekt eine bisher unbekannte Rolle von Knochenbelegzellen in der Regulation des Knochenumbaus entdeckt. Knochenbelegzellen differenzieren sich aus knochenbildenden Osteoblasten und bedecken die gesamte ruhende Knochenoberfläche. Bisher wusste man, dass Sexualhormone - also Östrogene und Androgene - den Knochenstoffwechsel über die Expression von Receptor activator of NF-B ligand (RANKL) regulieren. RANKL ist ein Botenstoff, der für die Differenzierung und Aktivierung von knochenabbauenden Osteoklasten essentiell ist. Gesteigerte Expression von RANKL führt zu vermehrtem Knochenabbau und Osteoporose. Es war bisher umstritten, welche Zielzellen im Knochen vermehrt RANKL exprimieren, so dass es im Sexualhormonmangel zu einem verstärkten Knochenabbau kommt. Durch eineKombinationverschiedener Analysemethoden ist es nun in Mausexperimenten gelungen, zu zeigen, dass die gesteigerte Expression von RANKL in der Zellmembran von Knochenbelegzellen die Zunahme des Knochenumbaus im Östrogenmangel bewirkt. Um das Zellkompartiment näher einzugrenzen, dessen gesteigerte RANKL-Expression für die Sexualhormonmangel-induzierte Osteoporose verantwortlich ist, verwendeten wir ein genetisch verändertes Mausmodell, in dem wir durch Knochenmarkstransplantationen und einen spezifischen Antikörper gegen humanes RANKL selektiv RANKL aus der blutbildenden oder der mesenchymalen Zellreihe hemmen konnten. Im Knochen gibt es zwei große Zellkompartimente: Das hämatopoetische Kompartiment, das alle roten und weißen Blutkörperchen sowie Osteoklasten umfasst, und das mesenchymale Zellkompartiment, das Osteoblasten, Osteozyten (allseits von Knochen umgebene Zellen), knorpelbildende Chondrozyten und eben auch Knochenbelegzellen an der Knochenoberfläche einschließt. Es zeigte sich, dass in Östrogen- und Androgen-defizienten Mäusen nur die Hemmung von RANKL, das von mesenchymalen Zellen produziert wurde, den Knochenturnover beeinflusste. Die Hemmung den RANKL aus hämatopoetischen Zellen blieb ohne Wirkung auf den Knochen. Um die Ergebnisse weiter zu verfeinern, etablierten wir eine neue Technologie, mit der man mit Hilfe eines Lasers bestimmte Zellen aus Gefrierschnitten von Knochen ausschneiden und analysieren kann. Es zeigte sich, dass im Östrogenmangel die Expression von RANKL selektiv in Knochenbelegzellen, nicht aber in Osteoblasten und Osteozyten, hochreguliert wurde. Bisher nahm man an, dass Osteozyten und hämatopoetische Zellen den Knochenumbau regulieren. Das vorliegende Projekt leistet somit einen Beitrag zum Verständnis der molekularen und zellulären Mechanismen der Regulation des Knochenumbaus und verbessert unser Verständnis der Mechanismen, die Knochenerkrankungen wie Osteoporose zugrunde liegen.