Bindung der AAA ATPase Drg1 an präribosomale Partikel

Ribosomen sind jene Organellen aller lebenden Zellen, die für die korrekte Übersetzung der mRNA in die Aminosäuresequenz von Proteinen verantwortlich sind. Die 80S Ribosomen der eukaryontischen Zellen bestehen aus einer 60S und einer 40S Untereinheit, die aus verschiedenen ribosomalen RNAs (rRNAs) und ribosomalen Proteinen aufgebaut sind. Die Biogenese der Ribosomen ist einer der energieaufwändigsten Prozesse in lebenden Zellen. Sie ist am besten in der Bäckerhefe untersucht. In Hefe werden ca. 200 Reifungsfaktoren für diesen Prozess benötigt, die mehr oder weniger transient mit den Vorläuferpartikeln interagieren und spezifische Aufgaben, wie z.B. Prozessierung der rRNA, Assemblierung der ribosomalen Proteine oder Rekrutierung von weiteren Reifungsfaktoren erfüllen. Viele dieser Faktoren binden bereits im Nukleolus an die Vorläuferpartikel und verlassen diese noch innerhalb des Zellkerns. Einige Faktoren sind jedoch "Shuttling"-Proteine und begleiten die Partikel in das Zytoplasma, wo sie abgelöst und in den Zellkern rückgeführt werden müssen, um die Ribosomenbiogenese aufrecht zu erhalten. Dafür sind zytoplasmatische Reifungsfaktoren verantwortlich. Wir konnten kürzlich zeigen, dass die AAA-ATPase Drg1 an zytoplasmatische pre-60S Partikel bindet und essentiell für die Freisetzung von "Shuttling"-Proteinen ist. Eine kürzlich von uns durchgeführte detailierte Charakterisierung zytoplasmatischer prä-60S Partikel von drg1 Mutanten zeigte, dass alle bisher bekannten "Shuttling"-Proteine und Exportfaktoren an diesen Partikeln akkumulieren. Dieser Befund zeigt, dass Drg1 den ersten zytoplasmatischen Reifungsschritt katalysiert. Zusätzlich konnten wir zeigen, dass Drg1 mittels seiner N-terminalen Domäne mit Kernporenproteinen der zytoplasmatischen Seite des Kernporenkomplexes in vivo und in vitro interagiert. Drg1 dürfte deshalb bereits an die präribosomalen Partikel binden, wenn diese im Zuge des Exportes an der zytoplasmatischen Seite des Kernporenkomplexes erscheinen. Da mutierte Formen, die nicht mehr mit den Kernporenproteinen interagieren können, einen verminderten Gehalt von Drg1 auf den präribosomalen Partikeln aufweisen, ist die Interaktion wichtig für das Laden des AAA-Proteins an das prä-60S Partikel. In diesem Projekt werden wir detailiert untersuchen wie diese Interaktion stattfindet und welche Veränderungen dadurch in Drg1 induziert werden um die Bindung ans Partikel zu fördern und damit die nachfolgende Freisetzung von "Shuttling"- Proteinen zu gewährleisten. Dazu werden wir mittels verschiedener biochemischer, strukturanalytischer und genetischer Methoden untersuchen wie die Bindung von Nukleoporinen von der N-terminalen Domäne von Drg1 an die ATPase-Domänen kommuniziert wird. Im zu Drg1 verwandten humanen p97 Protein führt eine Störung dieser Kommunikation zu der dominante Erbkrankheit IBMPFD. Interessanterweise zeigen jene mutierten Formen von Drg1, die nicht mehr an die Kernporenproteine binden können, ähnlich veränderte enzymatische Eigenschaften wie die p97 IBMPFD Varianten. Deshalb könnten unsere Untersuchungen auch dazu beitragen die dieser Erkrankung zugrundeliegenden molekularen Mechanismen besser zu verstehen.

Ribosomen stellen die zelluläre Maschinerie für die Synthese neuer Proteine dar. Sie bestehen aus einer großen und kleinen Untereinheit und sind aus ribosomaler RNAs und Proteine aufgebaut. Die Bildung von Ribosomen ist eine der Hauptaufgaben jeder Zelle und folgt einem genau regulierten Ablauf, an dem mehr als 200 nicht-ribosomale Faktoren beteiligt sind. Beide Untereinheiten gehen aus einem gemeinsamen Vorläuferpartikel hervor, doch die Reifung und der Export aus dem Zellkern ins Zytoplasma erfolgt auf separaten Wegen. Die finalen Reifungsschritte im Zytoplasma umfassen den Einbau der letzten ribosomalen Proteine sowie die Ablösung und das Recycling von Reifungs- und Exportfaktoren. Ein Schlüsselfaktor der zytoplasmatischen Reifungsschritte ist das Protein Drg1, eine AAA-ATPase mit N-terminaler Interaktionsdomäne und zwei ATPase-Domänen, die es ihr ermöglichen chemische Energie in mechanische Kraft umzusetzen. Dieses Projekt beschäftigte sich mit der Frage, wie Drg1 an die große Untereinheit bindet und welche Funktion es im Zuge des Reifungsprozesses erfüllt. Wir konnten zeigen, dass Drg1 durch direkten Kontakt mit dem Protein Rlp24 an die große Untereinheit rekrutiert wird. Durch diese Interaktion wird Drg1 aktiviert und löst in einem energieabhängigen Prozess der beide ATPase Domänen von Drg1 involviert, Rlp24 vom prä-ribosomalen Partikel ab. Die C-terminale ATPase-Domäne (D2) ist dabei nötig um Rlp24 vom Partikel zu abzulösen, während die N-terminale ATPase-Domäne (D1) wichtig ist, um Rlp24 von Drg1 freizusetzen. Dieser Schritt ist notwendig um Rlp24 zu recyceln. Die Etablierung eines in vitro Modells, bei dem isolierte prä-ribosomale Partikel eingesetzt werden, erlaubte es uns diese Schritte im Detail zu untersuchen. Mithilfe dieses Modells konnten wir unter anderem zeigen, dass ein weiterer Faktor an der Freisetzung von Rlp24 beteiligt ist, das Kernporenprotein Nup116. Die Freisetzung von Rlp24 durch Drg1 ist der initiale Schritt der letzten Reifungsphase des prä-ribosomalen Partikels und eine zwingende Voraussetzung dafür, dass die darauf folgenden Schritte stattfinden können. Inaktivierung von Drg1 führt deshalb dazu, dass Reifungs- und Exportfaktoren nicht vom Partikel abgelöst werden und der Reifungsprozess zum Erliegen kommt. Daher können drg1-Mutanten als Werkzeuge eingesetzt werden, um bislang unbekannte Shuttling- und Exportfaktoren zu identifizieren und um die Kopplung von Partikelexport mit den folgenden Reifungsschritten besser zu verstehen. Die Resultate dieses Projekts lieferten deshalb nicht nur tiefere mechanistische Einblicke in die Funktionsweise von AAA-ATPasen, sondern unterstreichen auch die Bedeutung der zytoplasmatischen Reifungsschritte für die Bildung funktioneller Ribosomen.