E. histolytica: Thioredoxinsystem als Ziel von Metronidazol

Amöbendysenterie und Amöbenleberabszeß werden vom einzelligen Darmparasiten Entamoeba histolytica verursacht und sind in vielen Ländern dieser Welt verbreitet, mit bis zu 50 Millionen Erkrankungen jedes Jahr. Obwohl die Amöbiasis eine tödliche Erkrankung wäre, sterben im Vergleich nur sehr wenige Patienten, weil praktisch überall eine günstige orale Therapie mit Metronidazol verfügbar ist. Metronidazol ist ein wichtiges Antibiotikum, das schon seit 50 Jahren in Verwendung ist. Neben E. histolytica kann man damit ein breites Spektrum von mikroaerophilen und anaeroben Mikroorganismen wie z.B. Trichomonas vaginalis, Giardia intestinalis, Bacteroides spp. und Helicobacter pylori behandeln. Obwohl Metronidazol schon Millionen von Menschenleben gerettet hat, wissen wir immer noch nicht, wie im Detail E. histolytica oder andere Pathogene umbebracht werden. Es wurde jedenfalls eindeutig gezeigt, dass das Antibiotikum chemisch reduziert werden muß, um aktiv zu werden, und dass es mehrere toxische Metaboliten gibt. Bislang sah man das primäre Reduktionsprodukt, das Nitroradikalanion, als hauptverantwortlich für die Wirkung, die man sich als unspezifisch gegen Proteine und besonders auch DNA gerichtet vorstellte. Im Gegensatz dazu fanden wir in unserem vom FWF unterstützen Projekt heraus, dass in E. histolytica und T. vaginalis andere Reduktionsprodukte des Metronidazols Thiolgruppen nur in ganz bestimmten Proteinen kovalent modifizierten. In E. histolytica waren dies Thioredoxinreduktase, Thioredoxin, Superoxiddismutase, Purinnukleosidphosphorylase und ein kleines Protein mit einer Kohlehydratbindungsdomäne, das wir "metronidazole target protein-1" (MTP1) nannten. Wir entdeckten, dass Thioredoxinreduktase selbst das Metronidazol aktivierte, und so sind dieses Enzym und andere Komponenten des Thiol-abhängigen Redoxsystems die ersten Opfer des Metronidazols. Diese Vorgänge gingen mit einer starken Reduktion von kleinen Thiolmolekülen in der Zelle einher. Während unser abgeschlossenes Projekt das Thiol- abhängige Redoxsystem von E. histolytica als ein Hauptziel von Metronidazol entdeckt hat, richtet sich das neue hier vorgeschlagene Projekt auf die folgenden Fragen: Was sind die Hauptpartner der primären Zielmoleküle, insbesonders von Thioredoxinreduktase und Thioredoxin? Wo sind diese Komponenten lokalisiert? Wie hängen der Schaden am Thioredoxinsystem und dem Schaden am Zytoskelett zusammen? Was ist die Rolle von MTP1 in der Metronidazolwirkung? Welche kleinen Thiolmoleküle reagieren mit dem aktivierten Metronidazol? Ist die Schädigung der DNA Ursache oder Folge des Sterbens der Zellen? Insgesamt wollen wir das wichtige Thiol- abhängige Redoxsystem von E. histolytica und seine Rolle bei der Wirkung von Metronidazol besser verstehen lernen und die relevanten Zielmoleküle des Antibiotikums identifizieren, die in der Zukunft neue Angriffziele für verbesserte Wirkstoffe darstellen könnten.

Entamoeba histolytica ist ein humanpathogener einzelliger Erreger, der Amöbenruhr und Amöbenleberabszess verursachen kann. Obwohl die Krankheit lebensbedrohlich wäre, kann sie einfach mit Metronidazol behandelt werden, einem günstig herstellbaren Medikament, das schon seit über 40 Jahren erfolgreich verwendet wird. Metronidazol wird auch gegen andere Mikroorganismen verwendet, die in sauerstoffarmen Geweben leben, aber die Amöben sind am empfindlichsten und bislang sind noch niemals resistente Stämme von E. histolytica aufgetaucht. Trotz dieses großen Erfolgs sind noch viele Fragen über den Wirkmechanismus offen, und einige davon sollten in unserem Projekt bearbeitet werden. In unserem Vorläuferprojekt hatten wir das Thioredoxinsystem als wichtiges Angriffsziel von Metronidazol entdeckt. Dass das Thioredoxin tatsächlich mit einer großen Zahl von anderen Proteinen wechselwirkt, konnten wir in diesem Projekt zeigen. Am Beispiel der Serinacetyltransferase demonstrierten wir, wie das Enzym durch Oxidanzien geschädigt wird und durch Thioredoxin repariert werden kann. Schließlich konnten wir den Oxidationszustand des Thioredoxins in den Amöben messen, und überraschenderweise fanden wir das Thioredoxin in den Metronidazol-behandelten Amöben genauso aktiv und reduziert vor wie in den unbehandelten. Das bedeutet, dass es noch weitere bisher unbekannte Angriffsziele des Metronidazols in E. histolytica geben muss. In der späten Phase der Wirkung von Metronidazol und anderen toxischen Stoffen wird die DNA des Parasiten abgebaut. Da dieser Vorgang an den programmierten Zelltod erinnert, bei dem zelluläre DNasen die chromosomale DNA spalten, haben wir in den Datenbanken nach E. histolytica Nukleasen gesucht. Zwar fehlen den Entamöben die klassischen Caspase-abhängigen DNasen und Endonuklease G, jedoch entdeckten wir ein Homologes zur TatD Nuklease. Das in E. coli Bakterien nachgebaute Enzym hatte tatsächlich eine Magnesium-abhängige DNase Aktivität. So ist dies die erste Charakterisierung einer DNase, die in Metronidazol-behandelten Amöben den DNA-Zerfall bewirken könnte. Für die Behandlung von E. histolytica ist das Metronidazol ein echter Glückszufall. Gerade weil es so erfolgreich ist, ist es so interessant, herauszufinden wie es genau in den Amöben wirkt, und warum andere Mikroorganismen viel schneller als die Entamöben Resistenzen entwickeln. Dabei studieren wir die relevanten Faktoren und möglichen Zielmoleküle einzeln mit den Methoden von Biochemie und Molekularbiologie. Dabei glauben wir, dass die genaue Untersuchung dieses erfolgreichen Beispiels in Entwicklung neuer und dringend benötigter Antibiotika in der Zukunft erleichtern kann.