Biochemische Untersuchung der Stomatin-Funktion

Stomatin ist ein evolutionär altes Membranprotein, das von Archaea bis zum Menschen konserviert ist. Das lässt wichtige Funktionen für dieses Protein vermuten, die aber noch wenig geklärt sind. Stomatin ist an der cytoplasmatischen Seite von Zellmembranen verankert, es bindet Cholesterin und bildet hochmolekulare Komplexe in Cholesterin-reichen Membran-Mikrodomänen, die als "lipid rafts" bekannt sind. Weiters interagiert Stomatin mit verschiedenen Ionenkanälen und dem Glucosetransporter GLUT1 und moduliert deren Aktivität. Dabei spielt Cholesterin eine wichtige Rolle. Aufgrund dieser Eigenschaften und der Analogie mit dem topologisch ähnlichen Protein Caveolin wird Stomatin den integralen Gerüstproteinen zugeordnet. Neue Ergebnisse über die Struktur und Funktion von Stomatin ermöglichen es jetzt, detaillierte Fragen auf molekularer Ebene zu stellen, und zwar die Bedeutung seiner Struktur für die Bildung hochmolekularer Komplexe, die Bindung von Cholesterin und die "lipid raft"-Assoziation. In der Folge können die Auswirkungen auf die Membran-Organisation und die Wechselwirkung mit GLUT1 untersucht werden. Im vorliegenden Projekt planen wir, diese Aspekte hauptsächlich mit biochemischen und proteomischen Methoden zu analysieren. Die in vitro- Daten werden aber durch Einzelmolekül-Mikroskopie-Untersuchungen an lebenden Zellen ergänzt. Diese Analysen werden in Zusammenarbeit mit dem Institut für Biophysik in Linz (Prof. Gerhard Schütz) durchgeführt. Dabei wird die Rolle der Stomatin-Palmitoylierung, der Cholesterin-Bindung, Assoziation mit negativ geladenen Membran- Phospholipiden, Assoziation mit Cytoskelett-Proteinen und mit "lipid raft"-Komponenten untersucht. Weiters ist geplant, unsere bisherigen Studien über die Stomatin-GLUT1-Wechselwirkung fortzuführen, die bereits gezeigt haben, dass Stomatin in menschlichen Erythrocyten als Schalter für die GLUT1-Spezifität von Glucose zu Dehydroascorbat (DHA) wirkt. Durch diese Funktion ist in menschlichen Erythrocyten die GLUT1-vermittelte Glucose-Aufnahme erniedrigt, der DHA-Einstrom jedoch erhöht. Das führt zu einer besseren Ausnutzung von Ascorbat/Vitamin C und kompensiert auf diese Weise die Unfähigkeit des Menschen, Vitamin C zu synthetisieren. Unsere biochemischen Untersuchungen zur Stomatin-GLUT1-Wechselwirkung werden durch funktionelle Analysen in Zusammenarbeit mit der Gruppe von Naomi Taylor in Montpellier (F) ergänzt. Zusammenfassend wird dieses Projekt über die Funktionen von Stomatin bei der Organisation von Membranen, sowie bei der Regulation von GLUT1 Aufschluss geben.

In diesem Projekt über die biochemische Untersuchung der Stomatin-Funktion haben wir mit zielgerichteten Methoden einzelne, hypothetisch wichtige Positionen in dem Stomatin-Molekül ausgetauscht. Die mutierten Konstrukte haben wir in einer passenden humanen Zelllinie exprimiert und die Mutanten mit zellbiologischen und biochemischen Methoden analysiert. Eines der Hauptthemen dieses Projekts war die Frage, ob Stomatin mit dem Glucosetransporter GLUT1 interagiert und welche Domäne dabei involviert sein würde. Es ist bekannt, dass die GLUT1-Aktivität durch Stomatin in einer Cholesterol-abhängigen Weise herabgesetzt wird. Da einige technische Probleme und der Mangel an Arbeitskräften diesen Projektpunkt problematisch machten, haben wir uns auf chemische Quervernetzungsstudien konzentriert, um die interagierenden Proteine zu bestimmen. Diese Strategie war erfolgreich und wir identifizierten GLUT1/SLC2A1 in den aus Erythrocytenmembranen isolierten, quervernetzten Stomatin-Komplexen. Interessanterweise haben wir dabei auch andere Membranproteine identifiziert, besonders den Anionenaustauscher Bande 3/SLC4A1 und den Wasserkanal Aquaporin-1. Weiters haben wir den Eisentransporter Ferroportin-1/ SLC40A1, den Harnstofftransporter-1/SLC14A1, die Calcium-Pumpe Ca-ATPase-4, das Integrin-assoziierte Protein CD47, sowie Flotillin-1 und -2 als Stomatin-interagierende Proteine identifiziert. Diese Ergebnisse legen nahe, dass Stomatin eine Rolle als integrales Gerüstprotein spielen könnte, so ähnlich wie die verwandten Flotilline und die topologisch ähnlichen Caveoline. Um diese Hypothese zu beweisen, können jetzt diese identifizierten Transporter in der Gegenwart oder Absenz von Stomatin getestet werden und ihre Aktivitäten gemessen werden. Weiters kann in Zukunft der Einfluss von der Membranlipid-Zusammensetzung, vor allem von den Cholesterol- und Sphingolipid-Konzentrationen untersucht werden, um die Funktion der Stomatin-abhängigen Membrandomänen (Stomatin-Rafts) aufzuklären. Unsere zellbiologischen und biochemischen Analysen der ausgewählten Punkt- und Deletionsmutanten haben großteils unsere Hypothesen bezüglich Stomatin-Oligomerisierung und Assoziation mit Membrandomänen bestätigt. Besonders der C-Terminus von Stomatin war essentiell für die Oligomerisierung und Raft-Assoziation. Die Verkürzung dieser Domäne hat eine dramatische Erhöhung der Mobilität dieses Moleküls ergeben, die unabhängig vom Cholesterol-Niveau war. Andererseits hat auch die Behandlung von Wildtyp-exprimierenden Zellen mit Cytochalasin D die Mobilität des Wildtyps stark erhöht. In ähnlicher Weise hat die Punktmutation eines C-terminalen Prolin-Rests ebenfalls zu einer Cholesterol-unabhängigen hoch-mobilen Mutante geführt. Diese Ergebnisse legen nahe, dass der C-Terminus von Stomatin mit Cytoskelett-Komponenten interagiert.