Entwicklung einer 5´trans-splicing Gentherapie

Dystrophe Epidermolysis bullosa (DEB) ist eine genetisch bedingte mechano-bullöse Hauterkrankung, die durch Mutationen im für Kollagen VII kodierenden Gen COL7A1 verursacht wird. Kollagen VII ist ein wichtiges Strukturprotein der Basalmembranzone(BMZ), die die Verbindung zwischen Epidermis und Dermis herstellt. Fehlende Funktionalität oder Abwesenheit von Kollagen VII resultiert in einer Spaltbildung unterhalb der Lamina densa infolge geringster mechanischer Belastungen, die sich in einem bullösen Phänotyp mit charkteristischer Blasen und Erosionsbildung an Haut und Schleimhäuten manifestiert. Col7A1 eignet sich aufgrund der Transkriptlänge von 9,2kb schlecht für eine klassische Gentherapie, da die meisten viralen Vectoren nicht so große Kapazitäten aufweisen. Dieses Projekt verwendet daher SMaRT (Spliceosom mediated mRNA trans-splicing) für die Korrektur aller Mutationen 5 von Exon 64 in COL7A1. SMaRT ist eine Gentherapie auf RNA Ebene. Wir verwenden diesen auf mRNA basierenden Ansatz weil so auch dominant negative Mutationen korrigiert werden können, weil das korrigierte Gen unter endogenener Kontrolle bleibt und weil die Möglichkeit besteht nur einzelne Teile von Genen auszutauschen, was bei großen Genen wie sie in der Basalmembranzone der Haut vorkommen von Vorteil ist. Der natürliche Mechanismus des Trans-splicens wird ausgenutzt, indem ein PTM (pre trans-splicing molecule) ins Genom eingeschleust wird, das den Teil der Target mRNA enthält, der ersetzt werden soll. Das PTM erkennt und bindet seine Target pre-mRNA mithilfe einer spezifischen Bindedomäne. Der trans-splicing Prozess wird dann von der Splicingmaschinerie der Zelle durchgeführt, und das Resultat ist eine Wildtyp mRNA. Mit SMaRT können beliebige mutierte Teile des Target Gens ausgetauscht werden. Die kritischste Komponente Komponente eines PTMs ist seine Bindedomäne. Zur Selektion der besten Bindedomänen für humanes COL7A1 wurde bereits ein FACS Screen mit Fluoreszenzmolekülen entwickelt. Dieser Screen und die bestehenden Konstrukte sollen nun für den Tierversuch auf mus musculus adaptiert werden. Die besten PTMs für Mensch und Maus werden dann parallel endogen in humanen Pateienzelllinien bzw. murinen Keratinozyten einer Kollagen VII hypomorphen Maus getestet. Die Funktionalität der Konstrukte in DEB Zellen soll mittels RT-PCR, western blotting und Immunfluoreszenzfärbung gezeigt werden. In aus den korrigierten Keratinozyten gezogenen Hautäquivalenten soll durch Schnitte und Färbungen die Wiederherstellung einer intakten Basalmembranzone verifiziert werden. Dies sollen die letzten Schritte vor einer möglichen Tierversuchsstudie sein.

Dystrophe Epidermolysis bullosa (DEB) ist eine genetisch bedingte mechano-bullöse Hauterkrankung, die durch Mutationen im für Kollagen VII kodierenden Gen COL7A1 verursacht wird. Kollagen VII ist ein wichtiges Strukturprotein der Basalmembranzone(BMZ), die die Verbindung zwischen Epidermis und Dermis herstellt. Fehlende Funktionalität oder Abwesenheit von Kollagen VII resultiert in einer Spaltbildung unterhalb der Lamina densa infolge geringster mechanischer Belastungen, die sich in einem bullösen Phänotyp mit charakteristischer Blasen- und Erosionsbildung an Haut und Schleimhäuten manifestiert.COL7A1 eignet sich aufgrund der Transkriptlänge von 9,2kb schlecht für eine klassische Gentherapie, da die meisten viralen Vectoren nicht so große Kapazitäten aufweisen. Dieses Projekt verwendet daher SMaRT (Spliceosom mediated mRNA trans-splicing) für die Korrektur aller Mutationen 5 von Exon 64 in COL7A1. SMaRT ist eine Gentherapie auf RNA Ebene. Wir verwenden diesen auf mRNA basierenden Ansatz, weil so auch dominant negative Mutationen korrigiert werden können, weil das korrigierte Gen unter endogenener Kontrolle bleibt und weil die Möglichkeit besteht nur einzelne Teile von Genen auszutauschen, was bei großen Genen, wie sie in der Basalmembranzone der Haut vorkommen, von Vorteil ist. Der natürliche Mechanismus des Trans-spleissens wird ausgenutzt, indem ein PTM (pre trans-splicing molecule) ins Genom eingeschleust wird, das den Teil der Target mRNA enthält, der ersetzt werden soll. Das PTM erkennt und bindet seine Target pre-mRNA mithilfe einer spezifischen Bindedomäne. Der trans-splicing Prozess wird dann von der Splicingmaschinerie der Zelle durchgeführt, und das Resultat ist ein Wildtyp mRNA. Die kritischste Komponente eines PTMs ist seine Bindedomäne. Zur Selektion der besten Bindedomänen für humanes COL7A1 wurde bereits ein FACS-Screen mit Fluoreszenzmolekülen entwickelt. Dieser Screen und die bestehenden Konstrukte wurden nun für den Tierversuch auf Mus musculus adaptiert. Für Mensch und Maus wurden die besten Bindedomänen ausgewählt und endogen in humanen Patientenzelllinien bzw. murinen Keratinozyten einer Kollagen 7 hypomorphen Maus getestet. Wir konnten zeigen, dass die Konstrukte funktionell sind. Auf RNA Ebene wurde nach Behandlung mit den humanen Reparaturmolekülen wieder 75% des Niveaus aus gesunden Zellen im Vergleich zu 25% in Patientenzellen detektiert. Die murinen Reparaturmoleküle führten auch zu einer signifikanten Erhöhung des Kollagen 7 mRNA Niveaus, wenn auch nicht in dem Ausmaß der humanen Konstrukte. Die Ergebnisse wurden auf Proteinebene mittels Immunfluoreszenzfärbung von behandelten Zellen bestätigt. Für zwei humane Konstrukte, mit denen Mutationen in den ersten 64 Exons korrigiert werden können, wurde das Ergebnis auch im Western Blot und in künstlich hergestellten Hautäquivalenten bestätigt. In der künstlichen Haut konnte auch gezeigt werden, dass das wiederhergestellt Protein im Gewebe an der richtigen Stelle eingebaut wird.