Sauerstoff-Reaktivität von Pyranose Oxidoreduktasen

Reaktionen von Flavin-Oxidoreduktasen bestehen aus einer reduktiven Halbreaktion, in welcher das Substrat den Flavin-Cofaktor reduziert, und einer oxidativen Halbreaktion, in welcher das Flavin durch einen Elektron-Akzeptor re-oxidiert wird. Flavin-abhängige Oxidasen nutzen molekularen Sauerstoff als Elektronenakzeptor und produzieren Wasserstoff-Peroxid, Dehydrogenasen reagieren sehr langsam oder gar nicht mit Sauerstoff und übertragen Elektronen auf alternative Akzeptoren wie (substituierte) Quinone oder Redox-Proteine. Trotz intensiver Forschung konnte die chemische und strukturelle Grundlage der Sauerstoff-Reaktivität noch nicht entschlüsselt werden, spezifische Bindungsstellen für Sauerstoff oder alternative Akzeptoren konnten nicht gefunden werden. Wiewohl einige Aminosäuren in einzelnen Proteinen aus verschiedenen Strukturfamilien die Sauerstoff-Reaktivität entscheidend beeinflussen konnten keine klaren strukturellen Regeln identifiziert werden, die darüber entscheiden ob ein Enzym als Oxidase oder als Dehydrogenase arbeitet. Pyranose 2-oxidase und Pyranose Dehydrogenase sind zwei Flavin-abhängige Zucker-Oxidoreductasen aus (hauptsächlich) Basidiomyzeten, welche die regioselektive Oxidation verschiedener Aldopyranosen an C-2 (und seltener an C-3) katalysieren. P2Ox ist eine homotetramere Oxidase, PDH ist ein monomeres Glykoprotein und benötigt alternative Akzeptoren wie 1,4-Benzoquinone, das Ferricenium-Ion und Ferrizyanid. Beide gehören zur GMC-Familie der Flavoproteine, und ihre aktiven Zentren zeigen hohe Ähnlichkeit. Gene für beide Enzyme wurden in unserem Labor isoliert, und die heterologe Expression etabliert. Wir wollen mit einer Kombination aus gerichteter Labor-Evolution und semi-rationaler Proteinmodifikation die Sauerstoff-Reaktivität dieser beiden Enzyme verändern, und dafür entscheidende Aminosäuren identifizieren. Mini-Expressionsgenbanken von Enzymvarianten werden durch Sättigungsmutagenese hergestellt, sowie Expressionsgenbanken von zufällig mutierten p2ox- and pdh-Genen (durch Fehlerhafte PCR), und in einem parallelen Enzymtest auf Änderungen in der Reaktivität mit Sauerstoff und alternativen Akzeptoren durchsucht. Mutationen mit entsprechenden Effekten werden detailliert biochemisch charakterisiert werden. Die Ähnlichkeit der aktiven Zentren der beiden Enzyme erlaubt die Überprüfung des Effekts einzelner Aminosäuren-Änderungen, indem die gleichen sowie komplementäre Änderungen in beiden Enzymen eingeführt werden können. Neben dem wissenschaftlichen Aspekt hat diese Arbeit auch Relevanz für gewisse Anwendungen: Die störende Wasserstoff-Peroxid-Produktion durch P2Ox könnte vermieden werden, oder Biokatalyse-Prozesse mit der flexibleren PDH ohne komplexe Redox-Mediatoren- Regeneration könnte ermöglicht werden.

Das Projekt führte zur Identifikation verschiedener Aminosäuren rund um das Aktive Zentrum und den Flavin-Kofaktor der Zucker-Oxidoreduktase Pyranose 2-Oxidase (POx) welche bei Austausch gegen andere Aminosäuren die Fähigkeit des Enzyms, Sauerstoff zu aktivieren und als Oxidase zu reagieren, erheblich beeinträchtigen. Der Umbau eines strukturell und katalytisch ähnlichen Enzyms Pyranose Dehydrogenase (PDH), das Sauerstoff nicht als Elektronenakzeptor bei der Zucker-Oxidation verwenden kann, zu einer Oxidase war nicht erfolgreich, obwohl Aminosäuren an ähnlichen oder identischen Positionen ausgetauscht wurden. Eine tiefergreifende Änderung der Enzymstruktur, die die gesamte Architektur des aktiven Zentrums beeinflusst hätte, resultierte lediglich in instabilen und nicht-funktionellen Enzymen. Der Austausch lediglich einer Aminosäure erlaubte Elektronentransfer auf Sauerstoff in einem sehr geringen Ausmaß. Diese Aminosäure trägt den Flavin-Kofaktor mit einer kovalenten Bindung. Der Kofaktor ist in der Enzymvariante weiter gebunden, allerdings nicht-kovalent, was die Aktivität des Enzyms generell etwas herabsetzt. Ähnliche Mutationen in anderen Flavoproteinen haben sowohl zu ähnlichen als auch gänzlich anderen Ergebnissen geführt, ein klarer Trend ist nicht erkennbar. Die nicht-kovalente Bindung reduziert das Redoxpotential des Kofaktors und ist vermutlich verantwortlich für den möglichen Elektronentransfer auf Sauerstoff. Eine detaillierte Untersuchung zeigte, dass die erste Halbreaktion (Oxidation des Zuckers) auf etwa ein Drittel der Reaktionsgeschwindigkeit herabgesetzt wird, während die zweite (Re-Oxidation des Kofaktors durch Transfer der Elektronen auf einen Akzeptor) etwa auf das Doppelte beschleunigt wird. Inwieweit dies die Aktivierung des Sauerstoffs beeinflusst bleibt vorerst offen. Das Beispiel der Pyranose 2-Oxidase zeigte dass die Dehydrogenase-Aktivität eine robuster Prozess ist, der durch verschiedenste Aminosäure-Austäusche nicht negativ beeinflusst wird, dass jedoch die Oxidase-Aktivität auf einem delikaten Gleichgewicht verschiedenster Faktoren beruht und durch verschiedene Änderungen in der Aminosäuresequenz negativ beeinflusst werden kann. Eine detailliertere Untersuchung der Effekte dieser Änderungen auf die beiden Halbreaktionen sowie das Potential von Kombinationen dieser Änderungen soll in weiteren Arbeiten untersucht werden. Die Konversion einer PDH zu einer Oxidase, die für etliche biokatalytische Anwendungen sehr attraktiv wäre, bleibt vorerst ungelöst. Anwendungen der POx für Biosensoren oder enzymatische Biobrennstoffzellen, wo Elektronentransfer auf Sauerstoff und Produktion von Wasserstoffperoxid nachteilig und unerwünscht sind, könnten von Sequenzänderungen, die diese Eigenschaft reduzieren oder eliminieren, profitieren