Fukosyl- und Xylosyltransferasen in Gastropoden

Gastropoden sind in manchen Bereichen der Biotechnologie Hoffnungsträger, aber sie sind auch Zwischenwirte von Pathogenen oder Schädlinge in der Landwirtschaft. Aus allen diesen Gründen ist es besonders wichtig ihr Glykosylierungspotential genau zu kennen. Dazu müssen einerseits ihre Glykanstrukturen analysiert werden, und andererseits die an der Glykosylierung beteiligten Enzyme untersucht werden. Basierend auf unseren früheren Projekten, die sich mit der Analyse von N-Glykanen beschäftigt haben, wissen wir, dass die Gastropoden in ihren Glykanstrukturen Elemente von Säugern, Pflanzen, Insekten und Nematoden miteinander kombinieren. Besonders die Fukosylierung und die Xylosylierung zeigen eine hohe Variabilität. Von anderen Organismen ist bekannt, dass gerade diese Zucker eine bedeutende Rolle in Glykan - basierenden Erkennungsprozessen spielen. Ihre Gegenwart oder Abwesenheit ist in manchen Fällen ausschlaggebend für die Funktion oder die Bindung. Diese Glykanmodifikationen sind einerseits von dem Vorhandensein der entsprechenden aktivierten Substrate abhängig, und andererseits, von der Expression der entsprechenden Fukosyltransferasen und der Xylosyltransferase. Bisher wurden zwar in Schneckengeweben einige dieser Enzyme nachgewiesen, aber noch niemals kloniert, oder im Detail mit den entsprechenden Enzymen von anderen Organismen verglichen. Das Ziel dieses Projekts ist die Reinigung und Charakterisierung der folgenden Enzyme, die für die Modifikation von N-Glykanen in Schnecken verantwortlich sind: der Core a1,6-Fukosyltransferase, der Core a1,3- Fukosyltransferase, der a1,3-Fukosyltransferase, die terminale Zucker fukosyliert, der a1,2-Fukosyltransferase, die terminale Zucker fukosyliert und der ß1,2-Xylosyltransferase. Die Enzyme sollen mit spezifischen Assays nachgewiesen werden. Darauf folgt die Etablierung einer cDNA Bibliothek in einem Expressionsvektor, welcher dann in Wirtszellen eingebracht wird. Die transfizierten Zellen, die die funktionelle cDNA der gewünschten Enzyme enthalten, können nun mit Antikörpern oder Lektinen erkannt werden und aufgrund der modifizierten Glykane an ihrer Oberfläche isoliert werden. Die Gastropodenenzyme werden dann mit bereits bekannten analogen Enzymen bezüglich ihrer Substratspezifität und anderer biochemischer Parameter verglichen. Die detaillierte Kenntnis des Verhaltens dieser Enzyme, die so wichtig für die Bindung und die Signalweitergabe sind, wird helfen, das Wissen über die Glykosylierung in wirbellosen Tieren zu vertiefen. Im Zuge dieses Projekts werden zum ersten Mal rekombinante Fukosyl- und Xylosyltramsferasen aus Gastropoden hergestellt.

Mollusken sind ein großes und evolutionär sehr erfolgreiches Phylum der Tiere. Sie sind wichtige Elemente zahlreicher Ökosysteme. Sie sind beim Abfallabbau und an Reinigungsprozessen beteiligt, werden aber häufig nur negativ, als Plage in der Landwirtschaft oder als Teil des Lebenszyklus von Parasiten wahrgenommen. Aufgrund ihrer erfolgreichen Anpassungs- und Überlebensstrategien unter wechselnden Rahmenbedingungen sind sie interessante Forschungsobjekte bezüglich ihrer biosynthetischen Fähigkeiten. O-Glykosylierung ist eine häufige post-translationale Modifikation von Proteinen. Sie ist an physikalischen Eigenschaften, wie Konformation und Stabilität, Resistenz gegenüber proteolytischen Enzymen, Ladung oder hydrophilen Eigenschaften beteiligt. Sie dient aber auch als Merkmal in Wirt-Pathogen Erkennungsprozessen, beim Proteintransport in der Zelle und bei Zell-Zell-Interaktionen. Da die Glykosylierung ein wichtiger Faktor in verschiedenen biologischen Erkennungsprozessen ist, ist eine detaillierte Analyse der Glykosyltransferasen aus Schnecken ein erster Schritt um diffizile Erkennungsvorgänge, wie zum Beispiel die Interaktion zwischen Parasit und Zwischenwirt, zu verstehen. Bisher waren keine Informationen bezüglich der O-Glykosylierungs-Maschinerie von Gastropoden vorhanden. Im vorliegenden Projekt sollten nun Glykosyltransferasen aus verschiedenen Schnecken identifiziert, kloniert und exprimiert werden. Weiters sollte die die Enzymaktivität der rekombinanten Produkte analysiert und charakterisiert werden. Im Rahmen des Projekts wurde die allererste Glykosyltransferase aus Mollusken (Biomphalaria glabrata) identifiziert, kloniert und exprimiert. Dieses Enzym, eine UDP-GalNAc:polypeptid GalNAc Transferase (ppGalNAcT; EC 2.4.1.41), initiiert den ersten Schritt der mucin-typ O-Glykosylierung. Das Gen kodiert für ein Protein bestehend aus 600 Aminosäuren, das alle funktionellen Abschnitte aufweist, die für diese Enzymfamilie als charakteristisch angesehen werden. Sequenzvergleiche mit ppGalNAcTs von Menschen, Fliegen und Würmern zeigten hohe Ähnlichkeiten bei der strukturellen Architektur. Enzymspezifitätsstudien und die Analyse von biochemischen Parametern bestätigten die enge Verwandtschaft zu der Familie der ppGalNAcTs. Weiters wurde das zweite Enzym, das am Aufbau von O-Glykanen beteiligt ist, eine beta-Galaktosyltransferase, sowie eine alpha1,6-Fukosyltransferase nachgewiesen. Es konnte somit gezeigt werden, dass die grundlegenden Schritte der O-Glykosylierung auch für Mollusken Anwendung finden.