NMR-Untersuchungen von Siderocalin-Ligand Komplexen

Ziel dieses Projekts ist das Sichtbarmachen und die strukturelle Aufklärung von angeregten Proteinzuständen und zu untersuchen, inwieweit diese bislang unbeobachteten Zustände für die Interaktion mit biologisch relevanten Verbindungen wichtig sind. In dem geplanten Projekt wird daher eine neuartige experimentelle Konzeption zur Wirkstofffindung entwickelt, die über den momentanen, konventionellen strukturbasierten Ansatz hinausgeht. Die Proteine, an denen dieser neuartige methodische Ansatz exemplarisch durchgeführt werden wird, sind sogenannte Siderocaline, kleine, sezernierte, eukaryotische Proteine, die zur Familie der Lipocaline gehören. Siderocaline sind in der Lage, kleine Eisen-bindende Moleküle (Siderophore) mit sehr hoher Affinität (KD<0.5nM) zu binden. Ihre genaue Funktion ist noch nicht zur Gänze geklärt, jedoch wurde gezeigt, dass sie am Eisentransport, besonders während Wachstums- und Differenzierungsvorgängen, beteiligt sind. Neueste wissenschaftliche Ergebnisse weisen darüber hinaus auf eine Beteiligung an zellulären Wachstumsprozessen hin. In einem früheren Projekt gelang es uns bereits zu zeigen (Lise Meitner Projekt M1049-B05), dass Q83 nicht nur Enterobactin, ein bakterielles Siderophor, mit sehr hoher Affinität binden kann und somit zur Familie der Siderocaline gehört, sondern darüber hinaus auch in der Lage ist, ungesättigte Fettsäuren wie Arachidonsäure selektiv und mit sehr hoher Affinität (KD <25nM) zu binden. Überraschenderweise kann Q83 beide Liganden gleichzeitig binden und so einen bislang unbekannten ternären Komplex formen. Diese duale Bindungseigenschaft war bislang völlig unbekannt und bietet sehr interessante chemische Ausgangspunkte für die Entwicklung neuartiger und therapeutisch interessanter Wirkstoffe. Es erlaubt, Wirkstoffe zu entwickeln, die durch Fusion der essentiellen chemischen Fragmente der beiden Moleküle realisiert werden sollen (fragment based drug design, FBDD). Dafür ist aber eine genaue Kenntnis der Bindungseigenschaften der verschiedenen Moleküle (Liganden) eine notwendige Voraussetzung und wird daher das Hauptziel der Arbeit darstellen. Mittels NMR Spektroskopie werden die dynamischen und strukturellen Prozesse während des Ligandenbindungsvorganges an Q83 genau untersucht und allfällige strukturelle und dynamische Veränderungen mit atomarer Auflösung verfolgt werden. Bereits in unserem Labor durchgeführte Vorarbeiten zum Projekt zeigten eine unerwartete wechselseitige Beeinflussung der Ligandenbindung an den beiden Bindungsstellen für Arachidonsäure und Enterobactin ("Allosterische Regulation"). Die Bindung eines Liganden führt zu einer Stabilisierung eines energetisch angeregten Proteinzustandes, an den in weiterer Folge der zweite Ligand bevorzugt bindet. Die detaillierte molekulare Charakterisierung dieser allosterischen Regulation und deren Nutzung für struktur-basiertes Wirkstoffdesign ist der wesentliche Kern des gegenständlichen Projektes. Dass Arachidonsäure eine Vorläufersubstanz in der Biosynthese von Leukotrienen und Prostaglandinen, wichtigen Bestandteilen des zellulären Informationsnetzwerkes, ist, unterstreicht ihre Bedeutung in zellulären Wachstums- und Differenzierungsprozessen sowie ihre Beteiligung an Tumorprozessen. Die im Projekt untersuchten Verbindungen stellen somit auch wertvolle Ausgangspunkte für zukünftige Wirkstoffentwicklungen im Bereich anticancer drugs dar.

Nach erfolgreicher Genomsequenzierung verschiedener Organismen verlagert sich der Schwerpunkt der Forschung im Life Science Bereich auf die Charakterisierung der von den verschiedenen Genen kodierten Proteine. In dem geförderten Forschungsprojekt wurden Techniken aus der Bioinformatik, Biophysik, und Molekularbiologie interdisziplinär kombiniert, um neuartige Informationen über die strukturellen und dynamischen Eigenschaften von Proteinen zu erhalten und deren Bedeutung für Interaktionen mit zellulären Partnermolekülen zu gewinnen. Die gezielte (rationale) und selektive Manipulation von Proteinfunktionen ist zentral für die moderne pharmazeutische Forschung. Dieser mittlerweile klassische Ansatz beruht auf einer strukturellen Komplementarität zwischen Proteinbindungsstelle und pharmazeutischem Wirkstoff. Trotz zahlreicher Erfolge in der Vergangenheit zeigte sich in jüngster Zeit, dass die Einschränkung auf statische Aspekte der molekularen Struktur der Komplexität von Proteinen nicht gerecht wird und dynamische Aspekte daher in Betracht gezogen werden müssen. Dieses Forschungsprojekt beschäftigte sich mit dem Siderocalin-Protein Q83 und der Analyse seiner Proteindynamik (reversiblen, dynamischen Veränderungen der räumlichen Proteinstruktur). Ermöglicht durch charakteristische Ligandenbindungseigenschaften und aufgrund seiner zahlreichen Interaktionsmöglichkeiten mit weiteren zellulären Proteinbindungspartnern spielt dieses Protein eine bedeutende Rolle sowohl in der Tumorgenese (Metastasenbildung) als auch in verschiedensten Entzündungsprozessen. Eine genauere Kenntnis der zu Grunde liegenden molekularen Mechanismen wäre daher von entscheidendem Vorteil. Im Forschungsprojekt wurden mittels NMR Spektroskopie nun erstmals exemplarisch die dynamischen Eigenschaften dieser Proteinfamilie untersucht. Die Kernmagnetische Resonanz Spektroskopie (NMR) ist eine der Schlüsseltechnologien im Bereich der modernen Lebenswissenschaften. Der Anwendungsbereich der hochauflösenden NMR Spektroskopie erstreckt sich von molekularer Analytik im Bereich der organischen und pharmazeutischen Synthesechemie, über die 3D-Strukturanalyse von Proteinen und Nukleinsäuren in der Strukturbiologie und, damit verbunden, im strukturorientierten Medikamentendesign (Pharmazie). Die im Projekt ermittelten Struktur- und Dynamikdaten sind nicht nur von eminenter Bedeutung für ein Verstehen der zellulären Wachstumskontrolle und der Tumorgenese, sondern könnten in weiterer Folge auch als Ausgangspunkt für ein rationales Design von pharmazeutischen Wirkstoffen oder zur Entwicklung von modifizierten Liganden mit maßgeschneiderter Selektivität für potentielle diagnostische Anwendungen dienen. Erst Studien werden soeben in Kooperation mit der Medizin-Universität Wien begonnen.