Funktionelle Charakterisierung von CGI-58

Die Lipase ATGL (adipose triglyceride lipase) und das Protein CGI-58 (comparative gene identification 58) haben extrem wichtige Rollen in der Lipolyse, der Mobilisierung von gespeichertem Triacylglycerol in freie Fettsäuren und Glycerol. ATGL ist das geschwindigkeitsbestimmende Enzym der Triacylglycerol-Hydrolyse im Fettgewebe und katalysiert den Abbau von Triacylglycerol in ein Molekül Diacylglycerol und ein Molekül freie Fettsäure. Die Aktivität von ATGL wird in Gegenwart von CGI-58 bis zu 20-fach erhöht. Wie durch die bekannten Funktionen von ATGL und CGI-58 zu erwarten, leiden Patienten mit Mutationen in den Genen für CGI-58 oder ATGL unter Triacylglycerolakkumulation in verschiedenen Geweben. Allerdings zeigen Patienten mit Mutationen in CGI-58 zusätzlich einen Phenotyp mit schwerer Ichthyose. Dies weist auf eine zusätzliche Funktion von CGI-58 hin, die nicht mit der Stimulation von ATGL ident ist. Trotz dieser bekannten, großen Bedeutungen von CGI-58 im Lipidstoffwechsel und in der Haut, sind die verantwortlichen Mechanismen auf molekularer Ebene völlig unbekannt. Ziel der hier beantragten Forschung ist es, die Struktur-Funktions-Beziehung von CGI-58 aufzuklären: Die biologischen Funktionen von CGI-58 sollen besser verstanden werden, indem wir die Mechanismen der ATGL-Stimulation, der Bindung am Fetttropfen (Lipid droplet) sowie der kürzlich entdeckten Acyl-CoA abhängigen Acyltransferaseaktivität untersuchen. Ein breitgefächerter experimenteller Zugang wird verfolgt, um diese Ziele zu erreichen. Um die strukturellen Eigenschaften des Proteins besser zu verstehen, wurde ein 3D Homologiemodell basierend auf Sequenzhomologie mit anderen Proteinen berechnet. Interessanterweise zeigt das Modell, das sich der N-terminus von CGI-58 deutlich von der ansonst kompakten Struktur des Proteins abhebt. In unseren Vorarbeiten konnten wir auch eine kurze Region innerhalb dieses N-terminalen Bereiches identifizieren, welche essentiell für die Lokalisierung von CGI-58 am Lipid-Droplet ist. Da die Dispersion von CGI-58 vom Lipid-Droplet in das Cytosol nach Stimulation der Lipolyse eine wichtige Rolle in der Aktivierung von ATGL spielt, werden wir die Bindung dieser Peptidregion an die Lipid-Droplets mittels NMR Spektroskopie untersuchen. Unter Berücksichtigung des 3D Modelles soll auf biochemischen Wege die Anforderungen der Minimalsequenz von CGI-58 die für die Stimulierung von ATGL notwendig ist, bestimmt werden. Zusätzlich werden wir die erst seit kurzem bekannte Acyl-CoA abhängige Acyltransferase Aktivität von CGI-58 mit biochemischen und biophysikalischen Methoden charakterisieren. Somit werden die Ergebnisse dieser Studien unser Verständnis von CGI-58 im Lipid- und Phospholipidstoffwechsel auf molekulare Ebene maßgeblich verbessern.

Balance im Energiestoffwechsel ist durch unsere bewegungsarme Lebensweise oft nicht gegeben. Das führt zu großen gesundheitlichen Problemen in den betroffenen Individuen und stellt ein globales Gesundheitsproblem dar. Ungleichgewichte führen zu Diabetes, Herz- Kreislauf-Erkrankungen und dem metabolischen Syndrom. Freie Fettsäuren sind schädlich für den Organismus und sind mit Lipotoxizität assoziiert. Daher speichern Säugetiere überschüssige Fettsäuren aus der Nahrung als relativ inerte Triglyzeride, in welchen drei Fettsäuremoleküle mit einem Molekül Glyzerin verestert werden. Diese Triglyzeride werden in Fetttröpfchen vor allem im Fettgewebe gespeichert. Im Falle eines niedrigen Energieniveaus des Körpers können diese Triglyzeride wieder mobilisiert und dem biochemischen Abbaumechanismus der Fettsäuren zur Energiegewinnung zugeführt werden. Dieser Mobilisierungsprozess - auch Lipolyse bezeichnet - wird von verschiedenen Proteinen, den sogenannten Lipasen, durchgeführt und unterliegt unterschiedlichen Kontrollmechanismen. Die Abspaltung der ersten Fettsäure wird von der Adiposen Triglyzerid Lipase (ATGL) durchgeführt, deren Aktivität durch das Protein CGI-58 stimuliert wird. In diesem Projekt wurden die Rolle von CGI-58 und die dahinterliegenden Mechanismen genauer untersucht. Durch die Verwendung von unterschiedlichen biochemischen und biophysikalischen Techniken wurden Regionen der Proteine CGI-58 und ATGL identifiziert, welche für die Interaktionen von CGI-58 mit ATGL und den Fetttröpfchen essentiell sind. Die dreidimensionale Struktur der Region von CGI-58, welche die Interaktion mit den Fetttröpfchen herbeiführt, wurde durch Kernresonanzspektroskopie (NMR) bestimmt. Zusätzlich wurden neue Wechselwirkungen von CGI-58 mit anderen Proteinen entdeckt, welche gemeinsam zu einem konzertierten Ablauf der Lipolyse beitragen. Eine derart genaue Charakterisierung des Fettabbaus ist wichtig, weil nur durch detailliertes Verständnis der Vorgänge rational basierte therapeutische Interventionen möglich sind. Deshalb ist es auch essentiell zu verstehen, welch unterschiedlich physiologischen Prozesse das Protein CGI-58 beeinflusst.