Einfluss der Nitrierung von Aeroallergenen

Allergene können in Gegenwart von Ozon, Stickoxid und Wasser nitriert werden. Zudem ist eine Nitrierung bei Vorliegen von Entzündungsreaktionen, z.B. im Lungengewebe, möglich. Die Nitrierung betrifft primär Tyrosinreste und führt zur Bildung von Nitrotyrosin. Die Spezifität dieser Reaktion kann mit einer Vielzahl von Faktoren in Zusammenhang gebracht werden, u.a. mit der Position, die die jeweiligen Tyrosinreste innerhalb der Proteinstruktur innehaben, der Sekundärstruktur sowie dem eingesetzten Nitrierungsreagens. Der unter natürlichen Bedingungen ablaufende Reaktionsmechanismus ist im Detail nicht geklärt. Für Modellstudien wird Tetranitromethan (TNM) eingesetzt, um Proteine in vitro zu nitrieren und die biologische Wirkung nitrierter und nicht nitrierter Allergene miteinander zu vergleichen. In den letzten Jahren ist der Einfluss einer Nitrierung der Isoform 1a des Hauptallergens des Birkenpollens (Bet v 1a) auf dessen Immunogenität untersucht worden. Dabei konnte gezeigt werden, dass Serum von Birkenpollenallergikern Antikörper des IgE Typs enthält, die spezifisch gegen nitriertes Bet v 1a gerichtet sind, aber keine nennenswerte Kreuzreaktivität mit nicht modifiziertem Bet v 1a aufweisen. Offensichtlich generiert die Nitrierung von Bet v 1a neue Epitope, die ihrerseits die Expression von spezifisch gegen nitriertes Bet v 1a gerichteten Antikörpern hervorrufen. Durch die Nitrierung konnte eine im Vergleich mit nicht nitrierten Referenzproben vermehrte Präsentation von Peptiden durch dendritische Zellen bei gleichzeitiger Zunahme der Diversität der Epitope induziert wird. Dies ruft letztlich eine gesteigerte T-Zell Aktivierung hervor. Diese Resultate legen wesentliche Änderungen in der Allergenstruktur unter dem Einfluss einer Nitrierung nahe, die entweder zu einer verstärkten Aufnahme des Allergens oder einem vermehrten intrazellulären Abbau führen. Die bisherige Charakterisierung von nitriertem Bet v 1a hat zudem eine gesteigerte Tendenz zur Bildung von Multimeren nachgewiesen. Paralleluntersuchungen für das Graspollenallergen Phl p 5 zeigten zwar ebenfalls Multimerenbildung, allerdings keine erhöhte Serumreaktivität. Entsprechend kann die Nitrierung von Proteinen als selektiver Mechanismus verstanden werden, der nicht alle Allergene im selben Ausmaß betrifft. Die Zielsetzung des eingereichten Projekts umfasst die Untersuchung des Einflusses, den eine Nitrierung auf die Struktur der jeweiligen Zielallergene sowie auf die durch die modifizierten Allergene induzierte Immunantwort ausübt. Das Projekt ist in drei Fragestellungen untergliedert: (1) Untersuchung, ob die Titer von gegen nitrierte allergiespezifische Allergene gerichteten IgEs im Verhältnis zu nicht modifizierten Allergenen bei Allergikern generell erhöht sind. (2) Einfluss der Nitrierung auf die Proteinkonformation sowie die Aggregationstendenz unterschiedlicher Allergene. (3) Einfluss des Nitrierungsgrades auf die zuvor diskutierten immunologischen und physikalisch-chemischen Eigenschaften. Zu diesem Zweck werden in rekombinanten Allergenen mittels TNM unterschiedliche Nitrierungsgrade induziert und der Einfluss auf immunologische und physikalisch-chemische Eigenschaften untersucht. Der Nitrierungsgrad wird mit Allergen, die entweder in der Umwelt oder in vivo nitriert wurden, verglichen. Die letzte Fragestellung richtet den Fokus dabei auf das Birkenpollenallergen Bet v 1a. Die Ergebnisse des eingereichten Projekts werden nicht nur Antworten hinsichtlich des Einflusses einer Nitrierung von Proteinen auf allergische Reaktionen liefern, sondern auch über den Mechanismus der Proteinnitrierung an sich. Zudem soll das Projekt eine erste Aufklärung der wahrscheinlichsten Mechanismen der Proteinnitrierung sowie die Auswirkungen der Nitrierung auf die Proteinstruktur, die Proteinfaltung und die Wechselwirkung mit immunrelevanten Proteinen liefern. Die Einbeziehung unterschiedlicher Allergene dient der Erweiterung des Verständnisses hinsichtlich der Spezifität von Nitrierungsreaktionen und des Einflusses dieser chemischen Modifikation auf die Immunogenität.

Die Zahl der Allergiepatienten hat sich in den letzten Jahrzehnten in den Industrieländern erhöht. Die genaue Ursache für diese Zunahme ist unbekannt und derzeit werden unterschiedliche Erklärungsmodelle untersucht. So wurde gezeigt, dass Pollenallergene im Falle von Luftverschmutzung durch Ozon und Stickoxid chemisch modifiziert werden. Dabei stellt eine Nitrierung von Allergenen die häufigste chemische Modifikation dar und kann zu einer spezifischen Änderung der Allergeneigenschaften führen. Diese Kenntnis führte zu Untersuchungen hinsichtlich des Effekts von Allergennitrierungen auf allergische Reaktionen. Aus früheren Untersuchungen in unserem Labor ist eine erhöhte Immunantwort gegen nitrierte Allergene bekannt. Der zugrunde liegende Mechanismus ist allerdings unbekannt. Die durchgeführte Studie zielte auf eine Charakterisierung nitrierter Allergene auf verschiedenen Ebenen ab, mit dem Birkenpollenallergen Bet v 1.0101 als Modell.Die Immunantwort auf nitriertes Bet v 1.0101 wurde dabei unter Vermeidung von Tierversuchen mittels unterschiedlichster humaner Zellsysteme analysiert. Die Ergebnisse zeigten, dass bei Kontakt von Immunzellen mit nitrierten Allergenen der entzündungsfördernde Zweig des Immunsystems inhibiert wurde. Da im Antwortverhalten unseres Immunsystems ein Gleichgewicht zwischen allergischem und Entzündungspfad unseres Immunsystems besteht, fördert die Unterdrückung einer Entzündungsreaktion die Entstehung einer Allergie. In Zusammenarbeit mit dem Max-Planck Institut (Mainz, Deutschland) wurden drei Methoden zur Proteinnitrierung getestet. Neben einer routinemäßig im Labor durchgeführten klassischen Nitrierungsreaktion, wurden Allergene auch mit Ozon und Stickoxid sowie mittels einer Reaktion, die bei Entzündungen auftritt, nitriert. Die klassische Nitrierungsreaktion kann als Modell für biologische Nitrierungsmethoden verwendet werden, wobei Oxidation in der Luft und im entzündlichen Gewebe die Allergene zusätzlich beeinflussen kann. Im zweiten Teil des Projektes wurden strukturelle Änderungen, die unterschiedlichen Nitrierungsstellen sowie die resultierenden Varianten der nitrierten Allergene untersucht. Für die meisten analytischen Methoden müssen Proteine zur Analyse in kleine Stücke geschnitten werden, was zu einem Informationsverlust führt. In unserer Studie wurden intakte nitrierte Allergene mittels Kapillarelektrophorese mit UV- und massenspektro-metrischer Detektion (MS) analysiert. Neue analytische Methoden, in Kombination mit einer selbstentwickelten Schnittstelle für MS, wurden erfolgreich etabliert und eingesetzt. Zudem konnten unterschiedlichste biochemische Methoden miteinander verknüpft werden und erlaubten dadurch eine genaue Analyse der Proteinstruktur und der durch Nitrierung verursachten Änderungen. Ein wichtiges Ergebnis war die häufige Bildung stabiler Agglomerate, sogenannter Multimere, durch Nitrierung von Allergenen. Multimere Proteine/Allergene sind bekannt für ihre stimulierende Wirkung auf das Immunsystem.