Alkylglycerol Monooxygenase: Klonierung und Biochemie

Im menschlichen Körper kommt eine Vielzahl verschiedener Fettstoffe vor, die den Baustein Glycerin als Grundstruktur enthalten. Die Glycerinderivate, bei denen langkettige Kohlenstoffreste mit Esterbindungen gebunden sind, wurden bereits eingehend und gut untersucht. Jene mit einer Etherbindung sind weniger gut untersucht, und über ihren Stoffwechsel ist wenig bekannt. Sie kommen im Säugetierkörper in vielen Geweben vor und spielen wichtige Rollen z.B. in der Entwicklung des Gehirns, in der Reifung von Samenzellen und zum Schutz des Auges vor Kataraktbildung. Alkylglycerol Monooxygenase (Glyceryl Ether Monooxygenase, E.C. 1.14.16.5) ist das einzige bekannte Enzyme, das die Etherbindung zwischen dem Alkylrest und dem Glycerin spalten kann. Alkylglycerol Monooxygenase bildet damit einen entscheidenden Schritt im Abbau der Etherlipide. Die Sequenz dieses Enzyms ist noch nicht bekannt, und deshalb ist eine Erforschung der Biochemie und der physiologischen Rolle dieses Schrittes des Etherlipidabbaus derzeit nicht möglich. Ziel des vorliegenden Projektes ist es nun, der Alkylglycerol Monooxygenase eine Sequenz zuzuordnen, und damit eine Erforschung der Biochemie dieses Enzyms mit den Methoden des Standes der Technik zu ermöglichen. Dazu haben wir im vorangegangenen Projekt 19764 entscheidende Vorarbeiten geleistet. Wir haben Techniken entwickelt, dieses instabile Enzym mit hoher Empfindlichkeit nachzuweisen, und aus Zellmaterial effektiv zu extrahieren. Um die Sequenz zuzuordnen, planen wir, eine Suche mit funktionelle Expression in Xenopus laevis Oocyten durchzuführen. Mit dieser Technik sind auch schon anderen Enzymen, deren Reinigung nicht möglich war, Sequenzen zugeordnet worden. Wir konnten den entscheidenden Schritt dieser Technik bereits erfolgreich durchführen und zeigen, dass nach Injektion von Boten Ribonucleinsäure aus Rattenleber Xenopus Oocyten eine Tetrahydrobiopterin-abhängige Alkylglycerol Monooxygenase Aktivität exprimieren. Mit Standardmethoden werden wir davon ausgehend die Boten Ribonucleinsäure fraktionieren, und die Sequenz zuordnen können. Nach der Zuordnung der Sequenz planen wir, die Biochemie des Enzyms näher zu studieren. Wir wollen feststellen, welche Aminosäurereste für die Aktivität und welche für die Bindung des Cofaktors Tetrahydrobiopterin wichtig sind. Dazu planen wir, das Enzym rekombinant herzustellen und zu reinigen, und einzelne Aminosäurereste gezielt auszutauschen. Weiters wollen wir Bindungspartner des Enzyms finden. Dazu wollen wir zwei Methoden einsetzen, das Split Ubiquitinsystem der Hefe, und Affinitäts-chromatographische Reinigung von Proteinkomplexen aus transifizierten Säugetierzellen.

Das Ziel dieses Projekts war es, einem wichtigen Enzym des menschlichen Fettstoffwechsels, der Alkylglycerol monooxygenase, einen Ort in im Genom zuzuordnen und damit dessen Bauplan zu finden. Die Stoffwechselreaktion, die Alkylglycerol monooxygenase ausführt, war schon seit 1964 bekannt. Nicht gewusst hat man allerdings bisher, welches Gen in unserem Genom für diese Reaktion verantwortlich ist. Für den Menschen kennt man noch etwa hundert weitere Enzyme ohne zugeordnete Sequenz oder Geninformation. Für die meisten bekannten Stoffwechselenzyme wurde die entsprechende Sequenz durch Untersuchung des in reiner Form gewonnenen Enzyms entschlüsselt. Das war im Fall der Alkylglycerol monooxygenase jedoch nicht möglich. Dieses Enzym ist in der zellulären Membran verankert und sehr empfindlich. Jeder Versuch es aus der Membran herauszulösen um es in reiner Form zu gewinnen führt umgehend zum Verlust der Fähigkeit, die enzymatische Reaktion auszuführen. Um dieses Problem zu lösen, wählten wir einen neuartigen Ansatz. Da durch die intensiven Forschungen am menschlichen Genom praktisch alle Baupläne für Proteine des Menschen bekannt sind, musste in den Tausenden Genen/Bauplänen mit unbekannter Rolle auch der für die Alkylglycerol monooxygenase vorhanden sein. Zusätzlich nützten wir das umfangreiche Wissen über Motive im Bauplan der Proteine, die auf eine bestimmte Funktion schließen lassen. Eines dieser mehr als 10 000 Motive, das sogenannte Fettsäure-Hydroxylase Motiv, charakterisiert Proteine die Fette in einer Art spalten, die uns an die Alkylglycerol monooxygenase Reaktion erinnerte. Das menschliche Genom enthält mehrere Baupläne unbekannter Funktion die das Fettsäure Hydroxylase Motiv enthalten. Eine Prüfung dieser Baupläne durch deren Einbringen in kultivierte Zellen ergab dann dass tatsächlich ein Protein mit bislang unbekannter Funktion, das Transmembran-Protein 195 genannt worden war, für die Alkylglycerol monooxygenase Aktivität verantwortlich ist. Dieser wissenschaftliche Durchbruch erschloss die Alkylglycerol monooxygenase für die moderne wissenschaftliche Forschung. Es ist nun möglich, die Aktivität des Enzyms in kultivierten Zellen und in Modellorganismen zu verändern und zu beobachten, welche Folgen das für den Organismus oder die Zelle hat. Außerdem ist es nun möglich, in Datenbanken nach Krankheitsassoziationen der Alkylglycerol monooxygenase im Menschen zu suchen.