Simulation von oxidativen Veränderungen von Nukleinsäuren

Eine Vielzahl von Erkrankungen inklusive Krebserkrankungen geht auf die Schädigungen der Erbinformation (DNS) zurück. Sowohl bei der Mutagenese, der Genotoxizität und der Cancerogenese spielen Oxidationsreaktionen eine zentrale Rolle. Durch Oxidation werden reaktive Elektrophile erzeugt, die sich mit Nukleinsäuremolekülen verbinden können. Eine Klasse an reaktiven Elektrophilen sind reaktive Sauerstoffspezies (ROS); eine weitere Gruppe stellen (bio)aktivierte kleine Moleküle dar. Es gibt eine Reihe von In-vitro-Tests an Bakterien- und Säugetierzelllinien als auch In-vivo-Tests vor allem an Nagetieren, die zur Identifizierung von potentiell mutagenen Substanzen Verwendung finden. Trotz eines beachtlichen Erfolges wird immer wieder von Problemen hinsichtlich der Sensitivität berichtet. Dabei werden mangelnde metabolische Aktivierung, Nebenreaktionen mit biologischem Material (z.B. Proteine), ineffiziente Transporteffekte bzw. das Vorhandensein von Schutzmechanismen als Ursachen für das unzureichende Erkennen von potentiell mutagenen Substanzen angegeben. Aufgrund der damit verbundenen Schwierigkeiten wollen wir all diese biologischen Einflussfaktoren vollkommen ausschließen und ein rein instrumentelles Verfahren zum Studium der Reaktivität von synthetischen Nukleinsäuremolekülen mit potentiell mutagenen Substanzen inklusive ROS entwickeln. Die von uns konzipierte Technologie wird als online Elektrochemie (EC) - Flüssigkeitschromatographie (LC) - Massenspektrometrie (MS) bezeichnet. Dabei wird die EC zur Simulation von Oxidationsprozessen verwendet. Die LC dient zur Trennung der Oxidationsprodukte, was die anschließende massenspektrometrische Detektion und Charakterisierung vereinfacht. Ein großer Vorteil von EC/LC/MS ist der erzielbare Probendurchsatz. Analysenzeiten werden im Bereich von wenigen Minuten liegen. Darüber hinaus kann die Methode vollautomatisiert werden, was zusätzlich noch den Arbeitsaufwand erniedrigt. Im Rahmen dieses Projektes wollen wir mit Hilfe von EC/LC/MS Veränderungen auf Ebene der Nukleoside, Nukleotide und kurzen Oligomeren untersuchen. Durch letzteres werden wir in der Lage sein, auch die Sequenzspezifität von Veränderungen der DNS erkennen zu können. Identifizierte DNS-Modifikationen können als Biomarker fungieren, um in weiterführenden Studien unter anderem den Zusammenhang zwischen Exposition und Erkrankung untersuchen zu können. Die Ergebnisse unserer Studien werden helfen, die grundlegenden mechanistischen Prinzipien aufzuklären, die die Reaktivität zwischen Nukleinsäuren und aktivierten Molekülen steuern. Die fundierte Kenntnis der Mechanismen ist von zentraler Bedeutung in medizinischer, pharmazeutischer und toxikologischer Forschung zur Risikobewertung und Prävention, kann aber auch zur Entwicklung von neuartigen, noch wirksameren Medikamenten führen (z.B. Zytostatika, Chemopräventiva).

Eine Vielzahl von Erkrankungen inklusive Krebserkrankungen geht auf die Schädigungen der Erbinformation (DNA) zurück. Sowohl bei der Mutagenese, der Genotoxizität und der Cancerogenese spielen Oxidationsreaktionen eine zentrale Rolle. Durch oxidativen Stress werden reaktive Elektrophile erzeugt, die sich mit Nukleinsäuremolekülen verbinden und dadurch schädigen können. Eine Klasse an solchen reaktiven Molekülen sind reaktive Sauerstoffspezies; eine weitere Gruppe stellen (bio)aktivierte kleine Moleküle dar. Im Rahmen dieses Projektes haben wir neue Techniken entwickelt, die eine schnelle, einfache und zuverlässige Untersuchung des Einflusses von oxidativen Stress auf Nukleinsäuremoleküle erlauben. Nukleobasen, Nukleoside, Nukleotide und kurze Oligomeren wurden als Probenmaterial verwendet. Elektrochemische Methoden wurden zur Erzeugung oxidierender Bedingungen verwendet. Die Zusammensetzung der Reaktionsgemische wurde in der Regel nach chromatographischer Trennung mit der Massenspektrometrie charakterisiert. Die durchgeführten Experimente führten zu einer Reihe von neuen Erkenntnissen hinsichtlich der Reaktivität der einzelnen Bausteine der genetischen Information und des Einflusses von Modifikationen (z.B. Methylierung) auf die oxidative Stabilität von DNA und RNA. Diese fundierte Kenntnis der Reaktionsmechanismen ist von zentraler Bedeutung in medizinischer und toxikologischer Forschung und wird in der Folge neue Ansätze zur Risikobewertung und Prävention liefern können. Zum Schutz des genetischen Materials könnten z.B. Antioxidantien Verwendung finden. Unter dem Sammelbegriff Antioxidans wird eine Vielzahl von chemischen Verbindungen zusammengefasst, die eine unerwünschte Oxidation anderer Substanzen verhindern können. Wir konnten in einem weiteren Teil dieses Projektes zeigen, dass elektrochemische Methoden hervorragend zur schnellen und effizienten Charakterisierung von Antioxidantien geeignet sind. Speziell die Kombination aus Elektrochemie und Massenspektrometrie ermöglicht die simultane Identifizierung und Bewertung von antioxidative wirkenden Substanzen in komplexen Mischungen, was wir anhand der Analytik von Rot- und Weißweinproben demonstrieren konnten.