Regulierte Ubiquitinierung des Myosin Chaperons Unc45

Die Ubiquitinierung von Proteinen, d.h. die post-translationale Modifikation durch kovalente Anlagerung eines oder mehrerer Ubiquitin Moleküle, ist in allen Eukaryoten von zentraler Bedeutung für die Regulation und Beseitigung zellulärer Proteine. So leitet z.B. die Verknüpfung mit vier und mehr Ubiquitin Einheiten den Abbau der Proteine durch das 26S Proteasom ein, während die Anlagerung einzelner Ubiquitin Moleküle die Enzymaktivität, die Lokalisation oder die Interaktion eines Zielproteins mit anderen Proteinen beeinflussen kann. Aufgrund dieser gegensätzlichen Effekte, also Modifikation contra Abbau, muß das Ubiquitin-Proteasom System (UPS) sehr genau reguliert werden. In diesem Zusammenhang ist eine enzymatische, Ubiquitin-übertragende Kaskade bestehend aus dem E1 (Ubiquitin aktivierend), E2 (Ubiquitin konjugierend) und E3 (Ubiquitin an das Substrat ligierend) von besonderer Bedeutung. In Abhängigkeit vom jeweiligen E2/E3 Paar können verschiedene Lysine zur Ubiquitin-Ubiquitin Verknüpfung verwendet werden, um so spezifische Ubiquitin Ketten an bestimmte Lysinreste des entsprechenden Substrat-Proteins anzuhängen. Interessanterweise konnte vor kurzem ein weiterer Faktor in der E1/E2/E3 Enzymkaskade identifiziert werden, der für eine effiziente und prozessive Kettenverlängerung verantwortlicht ist. Um diesen E4-Prozessivitaets-Faktor geht es in diesem Proposal. Der Chn1/Ufd2 Komplex von Caenorhabditis elegans stellt das am besten charakterisierte E3/E4 Polyubiquitinierungs-System dar. Chn1 ist ein CHIP (Hsp70 Interacting Protein) Ortholog, während Ufd2 (Ubiquitin Fusion Degradation) ein Ortholog des Hefe Proteins Ufd2p ist, das dem 26S Proteasom direkt zuarbeitet. Sowohl Chn1 als auch Ufd2 besitzen eine E3 Ligase Aktivität, die auf einer C-terminal U-box Domäne lokalisiert ist. Allerdings muessen Chn1 und Ufd2 einen heterooligomeren Komplex bilden, um das Substrat Unc45, ein Chaperon fuer die Faltung und Assemblierung von Muskelproteinen, zu polyubiquitinieren und so seinen Abbau einzuleiten. Daneben konnte gezeigt werden, daß Ufd2 direkt mit dem E2-Enzym Let70 und dem Chaperon Cdc48 interagiert und so die zentrale Komponente eines Multiprotein Komplexes zur Ubiquitin Assemblierung darstellt. Wie in diesem Proposal skizziert, möchten wir eine Struktur-Funktionsanalyse des Chn1/Ufd2 System durchführen, um den molekularen Mechanismus der prozessiven Polyubiquitinierung und seiner Modulation durch bestimmte Effektorproteine zu verstehen. Zu diesem Zweck haben wir effiziente Reinigungsmethoden für die E3-Ligasen Chn1, Ufd2, das Substrat Unc45 und die Regulator Proteine Let70 und Cdc48 etabliert. Da wir alle Komponenten rekombinant und funktionell in großen Mengen herstellen können, befinden wir uns in der einmaligen Position, die Wechselwirkung zwischen E2/E3 (Let70/Ufd2), E3/E3 (Ufd2/Chn1), E2/E3/S (Ufd2/Chn1/Unc45) und dem Cdc48 Regulator mittels strukturbiologischer Methoden zu untersuchen. Durch Kombination dieser Ergebnisse mit in vitro Ubiquitinierungsstudien sollten neue Einblicke gewonnen werden, wie sich zwei E3-Ligasen zu einem E4-Faktor zusammenlagern und so den Abbau bestimmter Substrat Proteine durch deren Poly-Ubiquitinierung einleiten. Da die beiden E3 Ligasen Chn1 und Unc45 auch mit bestimmten Chaperonen wechselwirken, sollten unsere Ergebnisse auch wichtige allgemeine Erkenntnisse zur sogenannten Protein-Qualitäts-Kontrolle liefern. Zudem hoffen wir, die Funktion des Muskel Chaperons Unc45 und seine Bedeutung für bestimmte Protein (Mis)Faltungskrankeiten, wie z.B. einige Myopathien, besser zu verstehen.

Die Entwicklung und Funktion unserer Muskulatur basiert auf der kleinsten Einheit einer Muskelzelle, dem sogenannten Sarkomer. Die wichtigsten Bestandteile eines Sarkomers sind die kontraktilen Proteine Aktin und Myosin, die als mikroskopisch sichtbare Filamente in einer quasi-kristallinen Anordnung im Muskel vorliegen. Im Gegensatz zur Architektur des Sarkomers ist über dessen Entstehung noch sehr wenig bekannt. Besonders die Integration und Anordnung von Myosin in Muskelfibrillen wurde bislang nur unzureichend erforscht. Ein Hauptfaktor in diesem Prozess ist das UCS (UNC-45/Cro1/She4p) Protein UNC-45. Um den Aufbau der Protein-Maschinerie zu untersuchen, die für die Assemblierung der Myosinfilamente verantwortlich ist, führten wir eine umfassende Analyse des UNC-45 Proteins von Caenorhabditis elegans durch. Unsere strukturellen und biochemischen Daten zeigen, dass UNC-45 ebenfalls Filamente bilden kann, die eine Reihe von Bindungsstellen in definierter Geometrie für zuarbeitende Chaperone und das Substrat, Myosin anbieten. Demzufolge können die Hsp70 und Hsp90 Chaperone an mehreren Myosin Molekülen in genau festgelegter Periodizität arbeiten und diese in Form bringen. Dieses UNC-45 Montageband ist auch in vivo essentiell, um die Myosin-Faltung mit dem Einbau von Myosinfilamenten in Muskel-Sarkomere zu verbinden. Interessanterweise repräsentiert das UNC-45 Montageband einen neuen Typus eines Assemblierungsfaktors. Da UNC-45 auch an der Entwicklung von Muskelkrankheiten involviert ist, ist der gefundene Mechanismus auch von zentraler medizinischer Bedeutung, um Therapien gegen Myosin-Faltungskrankheiten (z.B. Inclusion Body Myopathy IBM) zu entwickeln.Ein wesentlicher Regulator des UNC-45 Proteins ist die Ubiquitin Ligase UFD-2, eine Komponente des Ubiquitin-Proteasome Systems. UFD-2 stellt ein hoch-spezialisiertes Ubiquitinierungs-Enzym dar, eine sogenannte E4 Ligase, die vorgeformte Ubiquitinketten auf bestimmten Substratproteinen verlängert. Trotz seiner wichtigen biologischen Rolle und seiner einzigartigen Ubiquitinierungs-Aktivität ist der molekulare Mechanismus von UFD2 weitestgehend ungeklärt. Um zu verstehen, wie UFD2 sowohl als allgemeiner "Housekeeping" Faktor als auch als spezifischer Regulator von UNC-45 fungiert, charakterisierten wir den Mechanismus der Substraterkennung in molekularem Detail. Im Gegensatz zu früheren Studien zeigen unsere in vitro und in vivo Daten, dass UFD-2 nicht an der Regulierung der Protein Level von UNC-45 in Muskelzellen beteiligt ist. Stattdessen kann UFD-2 das UNC-45 Chaperone als Adaptor verwenden, um Muskel Myosin zu ubiquitinieren und so dessen Abbau regulieren. Diese Analyse stellt einen wichtigen Schritt dar, um den Metabolismus eines der prominentesten zellulären Proteine, Myosin, besser zu verstehen.