Biokatalytische Disproportionierung von Enonen

Die asymmetrische Bioreduktion von aktivierten Alkenen katalysiert von Flavoproteinen der `old-yellow-enzyme` Familie generiert (bis zu) zwei Stereozentren und ist daher eine wichtige Methode zur Synthese von chiralen Carbonylverbindungen, Nitroverbindungen und verschiedenen Carbonsäurederivaten. Zum Recyclieren des Flavin- Cofaktors benötigen traditionelle Methoden einen zweiten (Nicotinamid)-Cofaktor als Hydrid-Transporter, der wiederum durch ein zweites Enzym (z. B. Glucose-, Formiat-, oder Phosphit-Dehydrogenase) regeneriert werden muss. Um die Komplexität dieser Systeme zu vereinfachen, wird der Flavin-Cofaktor über die enzymkatalysierte Disproportionierung von Enonen intern recycliert. Diese Enzymaktivität wurde im Allgemeinen als biochemische Nebenreaktion betrachtet. Das Projekt hat folgende Zielsetzungen: (i) Detaillierte Untersuchung der strukturellen Gemeinsamkeiten von `Dismutasen` und die Suche nach idealen Co- Substraten erweitert das Wissen um die fundamentalen biochemischen Aspekte der enzymkatalysierten Disproportionierung von Enonen und trägt signifikant zum Verständnis der katalytischen Fähigkeiten und der natürlichen Rolle von Flavoproteinen der `old-yellow-enzyme- Familie bei. (ii) Durch Ausnutzung dieser enzymatischen Nebenreaktion wird die Abhängigkeit von einem zweiten Nicotinamid-abhängigen Regenerationssystems bei der asymmetrischen Bioreduktion von aktivierten Alkenen vermieden, was die Komplexität von Flavin-Cofaktor-Recyclierungssystemen signifikant vereinfacht. Diese Systeme erlauben die Verwendung von organischen Lösungsmitteln, in denen hydrolyselabile Substrate, z. B. Carbonsäureanhydride, erfolgreich umgesetzt werden können. Das optimierte System wird dazu eingesetzt, um die Substratpalette von `old-yellow-enzymes` in Hinblick auf neue Typen von aktivierten Alkenen zu erweitern, die wichtige Synthesebausteine oder Produkte für Pharma- und Aromaprodukte sind. Das Hauptaugenmerk liegt auf a und ß - Aminosäuren (aus den entsprechenden a,ß-Dehydro-Vorstufen), O-geschützten Acyloinen (aus den entsprechenden &alphas;-substituierten Keto-Enolethern), a- und ß-substituierten Aldehyden (aus den entsprechenden Zimtaldehyd-Vorstufen), und ß-O-substituierten Methacrylat-Derivaten.

Der enzymatische Wasserstoff-Transfer von einem H-Donor auf ein ungesättigtes Substrat mit einer C=C-Doppelbindung ist eine elegante Methode, um bioaktive Verbindungen zu synthetisieren. Diese Methode ist speziell für die Pharma-Industrie relevant und findet auch in der Parfumsynthese Verwendung. Zum Beispiel werden sogenannte GABA-Analoga, die als Botenstoffe für die Nervenreizleitung (Neurotransmitter) verwendet werden, zur Behandlung von chronisch neuropathischem Nervenschmerz verwendet. Letztere Wirkstoffe können durch die Zuhilfenahme von sogenannten Ene-Reduktasen hergestellt werden. In ähnlicher Weise kann ein Aldehyd zur Darstellung des Aromas von Maiglöckchen synthetisiert werden, das Produkt findet in der Parfumindustrie Anwendung. Generell wird die Regeneration des oxidierten (verbrauchten) Cofaktors über einen indirekten Weg betrieben: der Flavin-Cofaktor in der En-Reduktase wird wiederum durch einen Nicotinamid-Cofaktor reduziert, was ein zweites (Helfer)Enzym zur Regeneration benötigt. Um diesen indirekten Regerations-Prozess zu vereinfachen und damit effizienter zu gestalten, wurde der direkte enzymatische Wasserstoff-Transfer von Ene-Reduktasen untersucht, der nur ein einziges Enzym benötigt. In einer ausführlichen Studie wurden geeignete Wasserstoff-Donor Moleküle getestet, mehrere Kandidaten konnten identifiziert werden, darunter das sogenannte 'Kaffee-Furanon', ein billiger Riechstoff, der in der Nahrungsmittel- und Getränkeindustrie als Zusatzaroma auf breiter Basis verwendet wird. Ein besonderes Augenmerk wurde auf die Darstellung von Verbindungen gelegt, die als Bild-Spiegelbild-Isomere auftreten. Diese konnten durch Enzyme erhalten werden, die ein stereo-komplementäres Verhalten zeigen. Alternativ dazu war es möglich, geeignete Schutzgruppen von unterschiedlicher Größe am Substrat anzubringen, um dessen Bindung in spiegelbildlicher Weise (Flip) in der Bindungstasche des Enzymes zu erzwingen. Ein Grundproblem, das beim direkten Wasserstoff-Transfer auftritt, ist die Bildung eines phenolischen Nebenprodukts, das die Aktivität der Ene-Reductase hemmt. Um diesen reversiblen Effekt zu umgehen, wurden mehrere Techniken zur Entfernung des inhibierenden Phenols untersucht: (i) Die Beimengung von adsorptiven polymeren Harzen bewirkt die selektive Adsorption des störenden Nebenprodukts, wodurch die Umsätze signifikant gesteigert werden konnten. Alternativ dazu konnten die Phenole in einer Kaskadenreaktion enzymatisch weiteroxidiert werden, wodurch deren inhibierende Wirkung unschädlich gemacht werden konnte. Ein großer Vorteil des direkten Wasserstoff-Transfers ist dessen Unabhängigkeit von Nicotinamid, das durch seine hohe Polarität nur in wässriger Lösung verwendet werden kann. Dadurch kann die Bioreduktion erstmals auch in organischen Lösungsmitteln durchgeführt werden, was die Umsetzung von wasserempfindlichen Verbindungen erlaubt. Zum Abschluss des Projektes konnte die Anwendung der unterschiedlichen Basis-Techniken an einem Pharma-Wirkstoff (Pregabalin) erfolgreich gezeigt werden.