Analyse von Hook1 Interaktionspartnern in der Spermiogenese

Eine Störung der männlichen Fertilität stellt ein zunehmendes Problem in unserer Gesellschaft dar. Zwar hat sich unser Wissen hinsichtlich der molekularen Abläufe während der männlichen Keimzellreifung in den vergangenen Jahren deutlich verbessert, trotzdem sind aber viele Prozesse bei der Bildung von befruchtungsfähigen Spermien unverstanden. Im Rahmen des Projektes soll die Funktion des Hook1-Gens und sechs weiterer Gene in der Spermiogenese untersucht werden. Wir konnten zeigen, dass das murine Hook1-Gen essentiell für die Bildung normaler Spermatozoen ist. In der Mausmutante azh (abnormal spermatozoon head shape) ist die Funktion des Hook1-Gens wegen einer Deletion zweier Exons gestört. Aufgrund dieser Mutation haben alle azh-Spermatozoen eine abnorme Kopfmorphologie, zudem finden sich Fehlbildungen in den Spermienflagellen und die Verbindung zwischen Kopf und Flagelle ist äußerst fragil, sodass es hier häufig zu einer Trennung kommt. Mit Hilfe von immunhistologischen Untersuchungen konnte Hook1 u. a. in der Manschette sowie im Anheftungsbereich von Flagelle und Kopf in murinen Spermatiden nachgewiesen werden. Bei der Manschette handelt es sich um eine transiente mikrotubuläre Struktur deren genaue Funktion in der Spermiogenese noch nicht geklärt ist, die aber wohl u. a. bei der Gestaltung des Spermatidenkopfes eine wichtige Rolle spielt. Zudem wird angenommen, dass entlang der Mikrotubuli der Manschette Transportprozesse erfolgen. Da Hook1 eine Domäne für die Bindung an Mikrotubuli aufweist, wird eine Rolle bei Funktion dieses Organells diskutiert. Aufgrund dieser Hypothesen haben wir ein "Hefe-Two-Hybrid Screening" durchgeführt und nach möglichen mit Hook1 interagierenden Proteinen gesucht. Hierbei konnten verschiedene Proteine bzw. Gene identifiziert werden, von denen 6 im geplanten Projekt näher analysiert werden sollen. Zunächst soll eine Verifizierung der Interaktion mit Hook1 durch Immunprezipitation und immunhistologische Untersuchungen erfolgen. Im weiteren Verlauf des Projektes soll dann die Funktion der 6 Gene in der Spermatogenese u. a. durch die Generierung und Analyse von "Knock out" Mäusen eruiert werden. Interessant ist auch die Klärung der Frage, ob durch den Ausfall von Hook1 in azh-Männchen die Expression bzw. die Lokalisierung von interagierenden Proteinen innerhalb der männlichen Keimzellen verändert wird. Insgesamt erwarten wir durch das Projekt ein besseres Verständnis zu den molekularen Prozessen während der haploiden Keimzelldifferenzierung. Auch sind neue Erkenntnisse im Hinblick auf die Bedeutung bzw. Funktion der Manschette für die Spermatidenreifung zu erwarten. Da das murine und humane Hook1 weitgehende Sequenzübereinstimmung zeigen, ist davon auszugehen, dass das humane HOOK1 eine vergleichbare Funktion zum murinen Gen hat. Daher sind durch das Projekt auch wichtige Erkenntnisse für die humane Keimzellreifung zu erwarten.

Eine Störung der männlichen Fertilität stellt ein zunehmendes Problem in unserer Gesellschaft dar. Zwar hat sich unser Wissen hinsichtlich der molekularen Abläufe während der männlichen Keimzellreifung in den vergangenen Jahren deutlich verbessert, trotzdem sind viele Prozesse bei der Bildung von befruchtungsfähigen Spermien unverstanden. Die Funktion des Hook1-Gens der Maus ist essentiell für die Entstehung befruchtungsfähiger Spermatozoen, Funktionsverlust führt zu Spermien mit abnormer Kopfmorphologie, Fehlbildungen in den Spermienflagellen und einer fragilen Verbindung zwischen Kopf und Flagelle. Eine ähnliche Bedeutung wird auch für das humane HOOK1 Gen vermutet. Wie genau der Funktionsverlust von Hook1 zu den Spermatogenese-Störungen führt ist allerdings noch unverstanden. Unsere Voruntersuchungen deuten aber darauf hin, dass Hook1 mit verschiedenen anderen (~26) Proteinen interagiert. Im Rahmen des Projektes wurden 6 dieser möglichen Interaktionspartner von Hook1 weiter analysiert. Tatsächlich konnte für alle 6 Proteine eine Interaktion mit Hook1 durch verschiedene Nachweissysteme belegt werden, wobei auch eine Eingrenzung der interagierenden Domänen erreicht wurde. Die weiteren Experimente konzentrierten sich auf die Charakterisierung des Ccdc181-Gens (RikenF23) und des IFT81-Gens der Maus. Es gelang beide Proteine in unterschiedlichen Stadien der männlichen Keimzellentwicklung zu lokalisieren. Während Ift81 u.a. entlang der gesamten Zilie nachgewiesen werden konnte, ist Ccdc181 auf den proximalen Bereich von Cilien bzw. Spermiengeißeln beschränkt. Besonders interessant ist dabei, dass Ccdc181 nicht nur mit Hook1 interagiert, sondern auch mit allen Untereinheiten der Protein-Phosphatase1. Diese Interaktion könnte für die Beweglichkeit der Spermatozoen von Bedeutung sein. Allerdings sind zur Überprüfung dieser Hypothese weitere Untersuchungen not wendig. Hierfür haben wir Konstrukte kloniert, um die Gene gezielt in einzelnen Geweben der Maus auszuschalten.