Heptosephosphat-Liganden

Gram-negative Bakterien verfügen über eine Vielfalt an Abwehrmechanismen gegen das Immunsystem ihrer jeweiligen Wirtsorganismen. Die äußere Membran der bakteriellen Zellwand enthält ein Glykolipid, das als Lipopolysaccharid bezeichnet wird, und das eine Reihe von Schutzfunktionen ausübt. Im Gegensatz zur äußeren Region dieses Polysaccharids, die eine hohe strukturelle Vielfalt aufweist, ist der innere Abschnitt - die Kernregion - wesentlich stärker konserviert und enthält häufig längerkettige Zucker wie Heptosen und 3-Desoxy- octulosonsäure (Kdo). Trotz der abschirmenden Wirkung der Polysaccharidkette auf den Kernbereich sind aber Wechselwirkungen der Kernregion mit Komponenten des angeborenen und adaptiven Immunsystems beschrieben worden wie beispielsweise die Interaktion mit monoklonalen Antikörpern und Lektinen. Eine detaillierte Untersuchung der Bindungseigenschaften mit den in der Kernregion vorhandenen Heptose-Einheiten wurde bislang nicht durchgeführt. Das Projekt zielt auf die strukturelle und molekulare Basis der Erkennung von Heptoseoligo-sacchariden und Heptosephosphaten durch ausgewählte Komponenten des angeborenen und adaptiven Immunsystems. Im Speziellen soll die Bindung der Heptoseregion an das Humane Surfactant Protein D, einem Vertreter der C- Lektine, untersucht werden, welches die Immunantwort in der Lunge reguliert. Dieses Protein agiert als Sofortabwehr gegen Mikroorganismen wie Viren, Bakterien und Pilze durch Aggregation der Erreger. Die Untersuchung der spezifischen Wechselwirkung mit der Heptoseregion soll durch chemische Synthese von Oligosacchariden bis zur Größe von Heptasacchariden erfolgen. Zur Synthese der komplexen Kohlenhydratstrukturen werden neue Donoren der Zuckerbausteine Heptose und Kdo erprobt werden und die konventionelle Reaktionsführung im Batch-Verfahren mit optimierten Reaktionsbedingungen in kontinuierlichen Durchflussmikroreaktoren verglichen werden. Die Oligosaccharide werden weiters als Liganden zur Charakterisierung eines kreuz-reaktiven, hoch-affinen und schützenden monoklonalen Antikörpers, WN1 222-5, der kürzlich erstmals kristallisiert werden konnte, eingesetzt werden. Da dieser Antikörper ein breites Spektrum an Gram-negativen Bakterien erkennt, bietet er das Potential für eine weitere Entwicklung zur Anwendung bei schwerwiegenden bakteriellen Infektionen bis hin zum septischen Schock. Die Bindungsstudien und röntgenkristallographischen Arbeiten sind gemeinsam mit etablierten internationalen Gruppen aus Deutschland, Kanada und USA geplant und umfassen immunchemische Tests, Oberflächen-Plasmon Resonanz und isotherme Mikrokalorimetrie ebenso wie Röntgenstrukturuntersuchungen der kokristallisierten Liganden mit dem Humanen Surfactant Protein D und dem monoklonalen Antikörper, WN1 222-5. Ergänzt werden diese Studien mit molecular modeling und NMR-spektroskopischen Messungen zur näheren Bestimmung der molekularen Details der Protein- Kohlenhydrat Wechselwirkung. Die Ergebnisse aus dem Projekt sollten allgemein zu einem besseren Verständnis der Wechselwirkung von geladenen Zuckern mit Proteinen führen und die Basis zur Entwicklung von Impfstoffen und besserer Therapiemöglichkeiten bei klinisch relevanten Infektionen erweitern.

Die Ergebnisse aus dem Projekt haben zu einem vertieften Verständnis der Wechselwirkung von bakteriellen Zelloberflächen-Kohlenhydraten mit Proteinen geführt und damit die Basis zur Entwicklung von Impfstoffen und für bessere Therapiemöglichkeiten bei klinisch relevanten Infektionen erweitert. Die äußere Membran der Zellwand Gram-negativer Bakterien enthält Lipid-gebundene Kohlenhydrate (Lipopolysaccharide) die vielfältige Interaktionen mit dem angeborenen und erworbenen Immunsystem eingehen. Im Projekt wurde ein strukturell konservierter Abschnitt des Lipopolysaccharids bearbeitet, der längerkettige Zucker mit 7 und 8 Kohlenstoffatomen enthält (Heptosen und 3-Desoxy-octulosonsäure = Kdo) um die Bindung an Antikörper und Lektine im molekularen Detail aufzuklären. Hierzu wurden durch chemische Synthese phosphathältige Kohlenhydrat-liganden mit verbesserter Methodik hergestellt und diese in Bindungsstudien sowie für strukturbiologische Untersuchungen (Röntgenkristallographie, Kernresonanzspektroskopie) eingesetzt. Im Speziellen wurde die Bindung der Heptoseregion an das Human Surfactant Protein D (hSP-D), einem Vertreter der C-Lektine, untersucht, welches die Immunantwort in der Lunge reguliert. Dabei zeigte sich, dass die bakteriellen Heptosen über mehrere potentielle Bindungsstellen (im Ring und in den Seitenketten) verfügen und sowohl von SP-D aber auch von bakteriellen Lektinen aus Burkholderien gebunden werden. Während die Bindung an SP-D zu einer effizienten Aggregation und Eliminierung der Erreger führt, ist die Bindung an die Burkholderien-Lektine für die Ausbildung von Biofilmen relevant. Eines der Burkholderien-Lektine kann sogar als Super-Lektin mit zwei unterschiedlichen Kohlenhydrat-Bindungsspezifitäten angesehen werden, die sowohl das Andocken an Epithelzellen als auch die Besiedlung der Zelloberflächen mit Burkholderien ermöglichen. Die Arbeiten an diesen Lektinen erfolgten in Kooperation mit Gruppen aus den USA und Europa (Frankreich, Tschechische Republik, Italien). In Kooperation mit Gruppen aus Deutschland und Kanada konnte erstmalig ein kreuz-reaktiver und schützender Antikörpers (WN1 222-5) mit einem bakteriellen Dodekasaccharid kristallisiert werden. Die Raumstruktur der im Antikörper gebundenen Kohlenhydratdomäne ist außerordentlich ähnlich der Bindung von Lipopolysaccharid an den Toll-like Rezeptor 4 und erklärt nunmehr auch die neutralisierende Wirkung des Antikörpers durch die kompetitive Bindung an diese Kernregion. Die detaillierten Bindungsstudien werden inzwischen noch weiter fortgesetzt. Als Ergebnis kann zusammenfassend festgehalten werden dass in vielen Gram-negativen Bakterien ein strukturell und räumlich konservierter innerer Kohlenhydratabschnitt vorliegt, der biomedizinisch relevante Interaktionen mit Kohlenhydrat-bindenden Proteinen eingeht.