Plasmamembran-Domänen in Characeen (Chlorophyta)

Plasmamembranen sind lateral in distinkte Domänen gegliedert. Dazu zählt man auch lipid rafts, dynamische Regionen mit einem Durchmesser von nur 10-200 nm. Sie sind mit Sphingolipiden und Sterolen anreichert und enthalten spezifische Proteine. Zahlreiche Untersuchungen an tierischen und pilzlichen Zellen belegen, daß die Raft-assoziierten Proteine an einer Vielzahl von Prozessen beteiligt sind, z. B. an Endo- und Exozytose, an Signalübertragung, Entwicklung und Pathogenerkennung. Über lipid rafts in den Zellen höherer Pflanzen und Algen ist noch wenig bekannt. Im Verlauf dieses Projektes sollen mehrzellige Grünalgen aus der Familie der Characeen untersucht werden. Ihre Internodialzellen enthalten bis zu einem m große, unbewegliche Plasmamembran-Domänen, die mit den fluoreszierenden Endozytosemarkern FM 1-43 und FM 4-64 angefärbt werden können. Da sie auch das sterol-spezifische Filipin binden handelt es sich vermutlich um Anhäufungen von lipid rafts. Die geplanten Studien sollen folgende Hypothesen bestätigen oder verwerfen: (1) Die Plasmamembran- Domänen der Characeen-Internodien sind in ihrer Lipid- und Proteinzusammensetzung ähnlich den lipid rafts. (2) Sie entstehen durch Fusion kleinerer, dynamischer Domänen und entsprechen komplexen Plasmamembran- Einstülpungen (Charasomen) in Internodialzellen der Gattung Chara aber nicht in Internodialzellen der Gattung Nitella. (3) Die Plasmamembran-Domänen sind am auswärts gerichteten Protonentransport und an der Photosynthese-abhängigen Aufnahme von Kohlenstoff beteiligt. Zur Klärung dieser Fragen werden biochemische und molekularbiologische Methoden, sowie konfokale Laserskanning-Mikroskopie und Elektronenmikroskopie verwendet. Die Ergebnisse werden unser Wissen über grundlegende Mechanismen der Membran- Kompartimentierung und des Transmembran-Transports erweitern und ermöglichen eine kritische Überprüfung der lipid raft-Hypothese.

Die Plasmamembran beherbergt zahlreiche Transportproteine, die einen Austausch von Ionen und Metaboliten ermöglichen. Um eine höhere Zahl von Transportern unterzubringen bildet die Grünalge Chara australis lokale Einfaltungen der Plasmamembran. Diese Charasomen sind an der Ansäuerung der Zelloberfläche beteiligt. Die Ansäuerung erleichtert die Aufnahme von Kohlenstoff, der für die Photosynthese erforderlich ist.Unsere Beobachtung, dass Charasomen durch fluoreszierende Farbstoffe in lebenden Zellen angefärbt werden können, erleichtern Untersuchungen zur Bildung und zum Abbau erheblich. Wir zeigen, dass die Bildung der Charasomen von der pH-Bänderung abhängt, einer Abfolge von sauren und basischen Bereichen der Zelloberfläche, die vermutlich durch unterschiedliche Aktivierung von gleichmäßig verteilten Protonen-ATPasen in der glatten Plasmamembran erfolgt. Nach Bildung der Charasomen und unter steady state Bedingungen bestimmt die Charasomenverteilung das pH-Muster auf Grund der erhöhten Membranfläche, die mehr Raum für die Unterbringung der Protonen-ATPasen erlaubt. Obwohl die Bildung der Charasomen Photosynthese-abhängig ist, ist keine räumliche Nähe zu Chloroplasten erforderlich. Dies weist darauf hin, dass die Charasomenbildung über einen mobilen Signalstoff induziert wird. Unsere Untersuchungen zeigen auch, dass die Charasomenmembranen über Vesikel des trans-Golgi Netzwerks angeliefert wird. Das weitere Wachstum erfordert die Hemmung der Endozytose (des Membran-Recyclings) über PIP3 und/oder PIP4 Kinasen. Diese Hemmung wird bei Inhibierung der Photosynthese durch Dunkelheit oder Chemikalien rückgängig gemacht und die Charasomen werden, zusammen mit den darin befindlichen Transportern, über coated vesicles abgebaut. Die Analyse des kortikalen Cytoskeletts zeigt, dass die Hüllmembran der Charasomen arm ist an Aktinfilamenten und Mikrotubuli. Dies stimmt mit der Beobachtung überein, dass der Abbau der Charasomen unabhängig vom Cytoskelett erfolgen kann. Unsere biochemischen und molekularbiologischen Daten zeigen, dass C. australis zwei Isoformen der Plasmamembran Protonen-ATPase besitzt, von denen nur eine, vermutlich die der Charasomen, bei Dunkelinkubation abgebaut wird. Untersuchungen von Clathrin, einem Protein das sowohl an der Bildung als auch am Abbau der Charasomen beteiligt ist, ergaben interessante Besonderheiten in der Sequenz der leichten Ketten. Schließlich liefern wir die ersten Beschreibungen von ARA6 and ARA7 in Grünalgen. Diese beiden RAB5 GTPasen sind am Vesikeltransport beteiligt und das Charasom-assoziierte ARA6 ist möglicherweise in der Charasomenbildung involviert.Unsere bisherigen Befunde zeigen, dass das Studium der Charasomen wichtige Informationen über zelluläre Strategien liefert, die eine effiziente Photosynthese in einer wässrigen Umgebung ermöglichen. Darüber hinaus erweisen sich die Charasomen als exzellentes Modell zur Untersuchung von Endo- und Exozytose.