In vivo Phosphorylierung von Kv7 Kanälen

Kv7 Kalium Kanäle umfassen Kv7.1 bis Kv7.5, und diese 5 Proteine sind für zahlreiche menschliche Erkrankungen (z.B. neonatale Epilepsien) von Bedeutung. Während Kv7.1 zum Aktionpsotential im Herzen beiträgt, steuern Kv7.2, Kv.7.3, und Kv.7.5 die neuronale Erregbarkeit. Die Funktion dieser Kanäle wird durch verschiedene Mediatoren und Neurotransmitter über G Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) streng reguliert, wobei die Reduktion von Phosphatidylinositol-4,5-Biphosphat (PIP2) in der Membran bzw. Ca2+/Calmodulin involviert sind. Außerdem konnte durch Phosphoprotein-Biochemie und Elektrophysiologie mit mutierten Kanälen gezeigt werden, dass auch Physophorylierung die Funktion dieser Kanäle beeinflusst. Allerdings geben diese Resultate keinen Aufschluss über die Phosphorylierung im lebenden Organismus, und für verfügbare Daten bezüglich dieser in vivo Phosphorylierung sind keinerlei funktionelle Konsequenzen beschrieben worden. Daher untersucht dieses Projekt die in vivo Phosphorylierung von Kv7 Kalium Kanälen durch "Proteomics" mittels Massenspektrometrie (MS), sowie deren funktionelle Folgen mittels Elektrophysiologie, Mutagenese und Immunfluoreszenz-Mikroskopie. Die geplanten Experimente werden mittels MS weitere in vivo Phosphorylierungsstellen in Kv7 Kalium Kanäle identifizieren um deren komplettes Phosphorylierungsmuster darzustellen. Weiters werden die involvierten Kinasen charakterisiert, die Bedeutung für die Modulation über GPCRs analysiert, die Rolle im Assemblieren und im Membraneinbau aufgeklärt und mögliche Veränderungen in der Spannungsabhängigkeit untersucht werden. Wir erwarten, so eine komplette Übersicht über die in vivo Phosphorylierungsstellen in Kv7 Kanälen zu erhalten und deren Bedeutung für die Modulation über GPCRs sowie für Assemblierung, Oberflächenexpression, und Aktivierung aufzuklären.

Neuronale spannungsabhängige Kalium Kanäle der Kv7 Familie (Kv7.2, Kv7.3 und Kv7.5) spielen eine grundlegende Rolle für die Kontrolle der neuronalen Erregbarkeit. Sie stabilisieren das Ruhemembranpotential und limitieren die Anzahl der gefeuerten Aktionspotentiale. Einige Mutationen in den KCNQ2 (für den Kv7.2 Kanal) und KCNQ3 (Kv7.3 Kanal) Genen verursachen kindliche Formen der Epilepsie. Aus diesem Grund wurden Epilepsiemedikamente entwickelt, die die Funktion dieser Kanäle verstärken. Ein bestimmtes Membranphospholipid, Phosphatityl-4,5-bisphosphat (PIP2), kontrolliert die Funktion vieler Membranproteine. PIP2 interagiert mit Zielproteinen üblicherweise über elektrostatische Wechselwirkungen, welche durch die Aminosäuresequenz des Proteins bestimmt wird. Die Funktion der Kv7 Kanäle wird durch die Verfügbarkeit von PIP2 bestimmt welche von G-Protein gekoppelten Rezeptoren genau reguliert wird. Unterschiedliche Kv7 Untereinheiten unterscheiden sich stark durch ihre Affinitäten für PIP2. Es ist jedoch unklar, was diese unterschiedliche Affinität verursacht, denn die Aminosäuresequenz in den vorgeschlagenen PIP2 Bindungsstellen unterscheidet sich nicht wesentlich in den verschiedenen Kanaluntereinheiten. In diesem Projekt wurden eine große Anzahl neuer Phosphorylierungsstellen in Kv7.2, Kv7.3 und Kv7.5 Kanälen bestimmt sowie die für diese Prozesse verantwortlichen Kinasen. Im Speziellen wurden fünf phosphorylierte Serine in Kv7.2 Kanälen gefunden, die in einer der vorgeschlagenen PIP2 Bindungsstellen gebündelt vorkommen. Dephosphorylierung dieser Serinreste führte zu einer Erhöhung der Affinität für PIP2. Das bedeutet, dass die Phosporylierung speziell dieser Serinreste notwendig ist, um die bekannt niedrige Affinität von Kv7.2 Kanälen für PIP2 zu gewährleisten. Nur diese niedrige Affinität ermöglicht die engmaschige Kontrolle der Kanäle mittels G-Protein gekoppelter Rezeptoren. Außerdem wurde durch diese Studie bewiesen, dass die elektrostatischen Eigenschaften eines Proteins nicht nur durch die Aminosäuresequenz selbst, sondern auf durch Posttranslationale Modifikation, im speziellen die Phosphorylierung, bestimmt werden kann. Interessanterweise besitzen Kv7.3 Kanäle in der homologen Region nur eine einzige Phosphorylierungsstelle. Es wäre interessant zu bestimmen, ob genau dieser Unterschied zwischen Kv7.2 und Kv7.3 Kanälen in der Anzahl der Phosphoyrlierungsstellen den 100-fachen Unterschied in der PIP2 Affinität erklären kann. Außerdem wurden in Kv7.2 und Kv7.5 Kanälen verschiedene Phosphorylierungsstellen gefunden, die durch Proteinkinase A (PKA) phosphoryliert werden. Jedoch unterscheidet sich sowohl die Anzahl, als auch die Lokalisation dieser Phosphorylierungsstellen. Interessanterweise verändern diese PKA- mediierten Phosphorylierungen nur die Funktion von Kv7.5 Kanälen und nicht die von Kv7.2 Kanälen. Spezifischen Inhibitoren von Proteinkinasen können in Zukunft helfen sowohl die Funktion der Kinasen, als auch die Funktion der Kanäle genauer zu bestimmen.