Destabilisierung von Mikrotubuli - eine neue Funktion von Plectin 1C

Plectin, eines der größten und vielseitigsten Cytolinkerproteine, bindet an sämtliche Typen von Inter- mediärfilamenten (IF) and weist alle Charakteristika auf, die man von einem multifunktionalen Vernetzungselement des Cytoskeletts erwarten kann, wie Multidomänenstruktur, verschiedenartige Bindungsaktivitäten und hohe Diversität an Isoformen. Plectin spielt auch eine Rolle bei strukturellen und dynamischen Aspekten des Aktinfilamentsystems und erweist sich so als Schlüsselfigur bei zahlreichen zellulären Vorgängen, die eine Umstrukturierung des Cytoskeletts erfordern. Die Interaktion von Plectin mit Mikrotubuli (MT) blieb bisher weitgehend unerforscht. Pilotversuche und vorangegangenen Studien von uns sowie anderen Forschungsgruppen legen den Schluss nahe, dass Plectin, insbesondere die Isoform P1c, an MT bindet, sie destabilisiert und so ihr dynamisches Verhalten beeinflusst. Angesichts der Vielzahl an zellulären Funktionen, die von einem dynamisch voll ausgeglichenen MT-Netzwerksystem abhängig sind, kommt diesen Befunden in Hinblick auf die durch Plectindefizienz hervorgerufenen pleiotropischen Phänotypen in Haut, Gehirn und Muskel potentiell große Bedeutung zu. Die wichtigsten Ziele dieses Projekts sind i) die Rolle von P1c als Destabilisator von MT zu bestätigen, ii) die molekularen Mechanismen der IF-Plectin-MT-Interaktion in Keratinocyten und Neuronen aufzuklären, iii) die Hypothese zu testen, dass Plectin (und IF) an der Regulation der MT-Dynamik beteiligt sind, und iv) die physiologische Bedeutung dieser Regulation zu analysieren. Vorrangig soll untersucht werden, welche Rolle P1c bei MT-abhängigen zellulären Vorgängen, wie Zellpolarisation und Vesikeltransport, speziell bei Glukoseaufnahme und synaptischer Transmission, spielt. Ein weiterer Fokus wird die Untersuchung der Nervenreizleitung sein, für die sich die Anzeichen mehren, dass sie ebenfalls von der MT-Dynamik beeinflusst wird. Die meisten dieser Studien sollen ex vivo mit primären Zellkulturen (Keratinozyten und Neuronen), isolierten intakten Neuronen, und immortalisierten (p53-/-) Zelllinien durchgeführt werden. Diese können allesamt aus bereits vorhandenen P1c- defizienten Mauslinien isoliert werden. Bei einem Großteil des Projekts soll live imaging Videomikroskopie zum Einsatz kommen, komplementiert mit in vitro Versuchen unter Verwendung rekombinanter Proteine. Keratinocyten und Neuronen sollen auch zur Identifizierung von P1c-interagierenden MT-assoziierten Proteinen (MAPs) herangezogen werden. Durch Aufklärung der Rolle von IF-Netzwerk-assoziertem Plectin bei MT-abhängigien Zellfunktionen in überlappenden Weise in Keratinozyten und Neuronen werden neue Erkenntnisse darüber erwartet, wie das IF-Netzwerksystem MT-abhängige Zelldynamik kontrolliert, und wie diese Interaktion die komplizierte Pathogenese beeinflusst, die durch Plectindefi-zienz hervorgerufen wird.

Das ubiquitär exprimierte Zytolinkerprotein Plectin, das von uns vor 30 Jahren entdeckt wurde, spielt eine entscheidende Rolle als Organisator und Regulator des Zytoskeletts. Mit Funktionsverlust verbundene Mutationen im Plectingen verursachen multi-systemische Krankheiten, von denen vor allem die Haut, die quergestreifte Muskulatur, das Nervensystem und Blutgefäße betroffen sind. In früheren Studien konnten wir zeigen, dass die Funktionstüchtigkeit des zytoskelettären Intermediärfilament-Systems, entscheidend von der Konsolidierung der Filamente durch Plectin-vermittelte Vernetzung und ortsspezifische Verankerung abhängt. Andererseits wird das höchst dynamische Actomyosin-Netzwerk, das kontraktile Kräfte entwickeln kann, von Plectin in einer Weise reguliert die seiner Dynamik förderlich ist. Das vorrangige Ziel des Projekts war es zu analysieren, ob Plectin in Partnerschaft mit Intermediärfilamenten einen ähnlichen Einfluss auf das dynamische Verhalten des Mikrotubuli (MT)-Netzwerks ausübt, und wenn ja, welche Konsequenzen sich daraus für zelluläre Funktionen ergeben, die von diesem dynamischen Zustand abhängig sind. Da eine der über 12 Plectinvarianten, die Isoform P1c, spezifisch an MT bindet und überdies auch die in Epithel- und Hirngeweben überwiegend exprimierte Isoform darstellt, war das Projekt auf die Rolle von P1c in epidermalen Keratinozyten und sensorischen Spinalganglion(SP)-Neuronen , fokussiert; weiters wurden Skelettmuskelzellen (Myozyten) untersucht. Das wichtigste Untersuchungsobjekt war eine Isoform-P1c-defiziente (knockout) Mauslinie, die zusammen mit einer Null-Mauslinie, der sämtliche Isoformen fehlten, und normalen (Wildtyp) Mäusen als Quelle primärer Zellkulturen für ex vivo Analysen dienten. Auf molekularer und zellulärer Ebene durchgeführte Untersuchungen zeigten, dass P1c Mangel sowohl in Keratinozyten als auch in SP-Neuronen zu erhöhter Stabilität und verminderter Dynamik von MT führte. Plectin-defiziente Muskelzellen erbrachten ähnliche Ergebnisse. Ex vivo Experimente und biochemische Analysen zeigten, dass Intermediärfilament-gebundenes Plectin der MT-stabilisierenden Wirkung von Tau, einem mit neuronalen MT assoziiertem Protein, entgegenwirkt. Damit konnte der molekulare Mechanismus der bei Plectinmangel auftretenden Stabilisierung und verminderten Dynamik von MT aufgeklärt werden. In Keratinozyten führte P1c-Mangel und die damit verbundenen Deregulierung von MT zu Störungen physiologischer Prozesse und Funktionen, einschließlich von Veränderungen der Morphologie und des Migrationspotentials von Zellen, erhöhtem Turnover von Fokaladhäsionskontakten, gesteigerter Glukoseaufnahme, Bildung aberranter Mitosespindeln und veränderter zellulärer Wachstumsraten. P1c Mangel in Neuronen führte zu verminderter Neuritenverzweigung, erhöhter Empfindlichkeit gegenüber oxidativem Stress, Beeinträchtigung des synaptischen Vesikeltransports und erhöhter Aufnahme von Glukose. Auf organismischer Ebene zeigten P1c-defiziente Mäuse beeinträchtigte Schmerzrezeption und Gedächtnisschwäche. Plectin ist daher als ein wesentliches Element in der Orchestrierung und kontrollierten Durchführung MT-abhängiger zellulärer Prozesse anzusehen. Ferner deuten die Ergebnisse darauf hin, dass die bei Patienten mit Plectin-Erkrankungen beobachteten Neuropathien auf reduzierte MT-Dynamik zurückzuführen sind.