Synthese von hochverdichteten RNA Microarrays

Ziel des vorliegenden Projektes ist die Entwicklung einer neuen Technik zur Synthese von RNA und chimeren DNA/RNA Microarrays zur Anwendung sowohl in der biochemischen Grundlagenforschung als auch auf dem Gebiet der Aptamer-Forschung für Nanotechnologie-basierte diagnostische und therapeutische Anwendungen. Die RNA Microarrays sollen in situ auf einer Glasoberfläche synthetisiert werden, wofür kürzlich entwickelte RNA Phosphoramidat-Monomere verwendet werden, die sowohl acetalische Levulinylester (ALE) als 2`-Hydroxyl- Schutzgruppen als auch Levulinyl- (Lv) und Dimethylformamidin- (DMF) als Basen-Schutzgruppen beinhalten. Die gezielte Anordnung und die Position der Nukleotidsequenzen auf den Microarrays wird durch selektives Entfernen der photo-sensitiven 5`-Nitrophenyl-propyl-oxycarbonyl (NPPOC) Schutzgruppe der RNA Phosphoramidate mit Hilfe eines digitalen, photolithographischen Systems im ultravioletten Lichtbereich erzielt. Mit Hilfe dieser Technik können bis zu 780 000 verschiedene RNA Sequenzen auf einem einzelnen RNA Microarray bzw. einem einzelnen RNA/DNA Microarray zur Detektion von RNA bindenden Proteinen angeordnet werden. Primär sollen die im Rahmen des vorliegenden Projektes entwickelten RNA bzw. RNA/DNA Microarrays auf dem Gebiet der molekularen Zellbiologie eingesetzt werden, um die post-transkriptionale Regulation von Genexpressionen zu untersuchen. Zwar ist bereits bekannt, dass post-transkriptionale Regulationen durch RNA Bindungsproteine eine Schlüsselfunktion bei der Genexpression besitzen, jedoch konnten die hierfür verantwortlichen Mechanismen, die nach aktuellem Kenntnisstand variieren und zum Teil hoch komplex sind, bisher noch nicht vollständig aufgeklärt werden. Im hier geplanten Projekt sollen RNA Microarrays zunächst verwendet werden, um die Sequenz-abhängigen Bindungsaffinitäten für das FBF-2 PUF Protein von Caenorhabditis elegans zu identifizieren. Das FBF-2 PUF Protein bindet die 3` nicht translationierte Region verschiedener mRNAs, um deren Translation und Stabilität zu regulieren und so z.B. die Proliferation von Stammzellen zu kontrollieren. Der PUF Proteinbindungs-RNA Microarray soll die Sequenz-spezifische Bindungsaffinität bestimmen, indem jede der 49 (262 144) Permutationen der neun Basen der entscheidenden Bindungsregion des Proteins des Wild-typs gld-1 FBEa mit einer 28 Basen- mRNA Sequenz einbezogen wird. Das vorliegende Projekt beinhaltet weiterhin die Synthese von chimeren RNA/DNA Microarrays, bei denen NPPOC geschützte RNA und DNA Phosphoramidate verwendet werden sollen. Mit Hilfe dieser chimeren RNA/DNA Microarrays soll der Mechanismus der 2`-Hydroxyl-Erkennung des FBF-2 PUF Proteins unter Berücksichtigung aller möglichen einzelnen und mehrfachen Sequenz-erhaltenden Mutationen von der RNA bis hin zur DNA des entscheidenden Bindungselementes von gld-1 FBEa identifiziert werden.

Ziel des vorliegenden Projektes war die Entwicklung einer neuen Technik zur Synthese von RNA und chimeren DNA/RNA Microarrays zur Anwendung sowohl in der biochemischen Grundlagenforschung als auch auf dem Gebiet der Aptamer-Forschung für Nanotechnologie-basierte diagnostische und therapeutische Anwendungen.Die RNA Microarrays sollten in situ auf einer Glasoberfläche synthetisiert werden, wofür kürzlich entwickelte RNA Phosphoramidat-Monomere verwendet wurden, die sowohl acetalische Levulinylester (ALE) als 2?-Hydroxyl-Schutzgruppen als auch Levulinyl- (Lv) und Dimethylformamidin- (DMF) als Basen-Schutzgruppen beinhalten. Die gezielte Anordnung und die Position der Nukleotidsequenzen auf den Microarrays wurde durch selektives Entfernen der photo-sensitiven 5?-Nitrophenyl-propyl-oxycarbonyl (NPPOC) Schutzgruppe der RNA Phosphoramidate mit Hilfe eines digitalen, photolithographischen Systems im ultravioletten Lichtbereich erzielt. Mit Hilfe dieser Technik konnten bis zu 780 000 verschiedene RNA Sequenzen auf einem einzelnen RNA Microarray bzw. einem einzelnen RNA/DNA Microarray angeordnet werden. Wir verwenden diese RNA-Sequenzen zur Detektion von RNA-bindenden Proteinen sowie zur Detektion von weiteren Affinitates- und enzym-vermittelten Interaktionen von spezifischer RNA. Darueberhinaus koennen wir DNA- und RNA-Synthesechemie fuer die Synthese von chimeren RNA/DNA Microarrays kombinieren und so identifizieren, wie RNA-bindende Proteine und Enzyme zwischen RNA und DNA unterscheiden.Primär wurden die im Rahmen des vorliegenden Projektes entwickelten RNA bzw. RNA/DNA Microarrays auf dem Gebiet der molekularen Zellbiologie eingesetzt, um die post-transkriptionale Regulation von Genexpressionen zu untersuchen. Zwar war bereits bekannt, dass post-transkriptionale Regulationen durch RNA Bindungsproteine eine Schlüsselfunktion bei der Genexpression besitzen, jedoch waren die hierfür verantwortlichen Mechanismen, die nach aktuellem Kenntnisstand variieren und zum Teil hoch komplex sind, zu Projektbeginn nur rudimentae bekannt. Im hier vorliegenden Projekt wurden RNA Microarrays zunächst verwendet, um die Sequenz-abhängigen Bindungsaffinitäten für das FBF-2 PUF Protein von Caenorhabditis elegans zu identifizieren. Das FBF-2 PUF Protein bindet die 3 nicht translationierte Region verschiedener mRNAs, um deren Translation und Stabilität zu regulieren und so z.B. die Proliferation von Stammzellen zu kontrollieren. Der PUF Proteinbindungs-RNA Microarray bestimmt nun die Sequenz-spezifische Bindungsaffinität, indem jede der 49 (262 144) Permutationen der neun Basen der entscheidenden Bindungsregion des Proteins des Wild-typs gld-1 FBEa mit einer 28 Basen-mRNA Sequenz einbezogen wird. Das vorliegende Projekt beinhaltete weiterhin die Synthese von chimeren RNA/DNA Microarrays, bei denen NPPOC geschützte RNA und DNA Phosphoramidate verwendet wurden. Mit Hilfe dieser chimeren RNA/DNA Microarrays wurde der Mechanismus der 2?-Hydroxyl-Erkennung des FBF-2 PUF Proteins unter Berücksichtigung aller möglichen einzelnen und mehrfachen Sequenz-erhaltenden Mutationen von der RNA bis hin zur DNA des entscheidenden Bindungselementes von gld-1 FBEa identifiziert.