Atypische Häm Peroxidase Familie

Heme Peroxidasen der hybriden Typen repräsentieren noch ganz unbekannte Protein Familien, die entdeckt waren während der phylogenetischen Analyse der gesamten Peroxidase-Katalase Superfamilie. Sie stellen die fehlende Verbindung zwischen Katalase-Peroxidasen, Cytochrom c Peroxidasen, Askorbat Peroxidasen und Mangan Peroxidasen dar. Wir haben vier verschiedene Sequenzen aus askomyceten Pilzen ausgewählt für die Untersuchung deren Expression und Ermittlung von biophysikalischen und biochemischen Eigenschaften. Zwei solche Sequenzen waren aus dem Reis Pathogen Magnaporthe grisea ausgewählt. In einer davon ist die Peroxidase Domäne mit der WSC Zuckerbindungsdomäne fusioniert. Der dritte Kandidat hat seinem Ursprung in dem pflanzenpathogen Sclerotinia sclerotiorum und besitzt eine ganz ungewöhnliche Sequenz für die distale katalytische Triade, die in keiner anderen von 5000 natürlichen Häm hältigen Peroxidasen bekannt ist. Die vierte Sequenz von dem Bodenpilz Chaetomium globosum besitzt eine Variation der distalen katalytischen Triade, die essentiell ist für die heterolytische Spaltung der peroxidischen Bindung. Unsere Untersuchungen starten mit der quantitativer RT-PCR für die Expression von ausgewählten Peroxidasen unter normalen und oxidativen Stress bedingten Kontidionen. Gleichzeitig werden auch die entsprechende peroxidatische Aktivitäten untersucht mit der Anwendung von spezifischen Inhibitoren zur Unterscheidung von mehreren möglichen Isozymen. Für die heterologe Expression sind geplannt entweder das einfache oder das fortgeschrittene Niveau. Während der einfachen heterologen Expression werden nur die Peroxidase Domänen mit einem C-terminalem His-tag in E. coli intrazellulär produziert. Während der fortgeschrittenen heterologen Expression werden die gesamte Gene, gewonnen aus der cDNA, in Pichia pastoris oder Aspergillus niger extrazellulär produziert. Das Ausmaß der Glykosilierung sowie die Anzahl von Disulfidbrücken wird zwischen natürlichen und rekombinanten Proteinen verglichen. Spektroskopische Untersuchungen werden die UV-vis, resonanz Raman und elektronischen Circular Dichroismus Methoden beinhalten. Stabilitätsuntersuchungen werden durch dynamische Differenzkalorimetrie ermittelt. Das Redoxpotential von Fe3+/Fe2+ wird mit optisch transparenter spektroelektrochemischen Zelle gemessen. Diese Messung ermöglicht die Erforschung von wertvoller Information über Eisen - Ligand Bindungsinteraktion sowie über Elektrostatik an der Grenzfläche zwischen Eisen und der Proteinumgebung. Zum Schluß sollen die pre-steady state und steady state Kinetik die essentiellen Informationen über den Reaktionsmechanismus dieser anwendung- versprechenden Peroxidasen mit vielen verschiedenen Substraten ermitteln. Dabei werden die reaktive Zwischenprodukte genannt Compound I, Compound II und Compound III spektroskopisch ertappt und aufgrund ihrer Reaktivität wird das wahrscheinlichste natürliche Substrat deduziert.

Das Forschungsprojekt Atypische Häm Peroxidase Familie untersuchte eine völlig neue und unbekannte Protein Familie von hämhältigen Peroxidasen die sich phylogenetisch an der Grenze zwischen ausgeprägten Strukturklassen der Peroxidase-Katalase Superfamilie befinden. Bifunktionelle Katalase-peroxidasen, monofunktionelle Askorbat Peroxidasen, Cytochrom c Peroxidasen, Lignin und Mangan Peroxidasen, sowie pflanzliche sekretorische Peroxidasen als Hauptrepresentanten dieser umfangreichen Superfamilie sind schon seit Jahrzenten bekannt und besitzen verschiedene essentielle physiologische Funktionen in Bakterien, Archaeen, Pilzen und Pflanzen bei detoxifizieren verschiedener reaktiven Sauerstoffspezies, hauptsächlich Wasserstoffperoxid. H2O2 ensteht nicht nur als metabolisches Nebenprodukt, aber besitzt auch eine wichtige Signalisierungsfunktion für die Zellen. Es gibt signifikante Unterschiede in der Reaktivität und Funktion von erwähnten Peroxidasen trotz hoher Konservierung von ihren Aktivzentren. In Rahmen dieses Projektes haben wir intensiv nach den evolutionären Intermediaten zwischen diesen verschiedenartigen Oxidoreduktasen gesucht und waren fündig für zwei Hybrid Häm- Peroxidase Familien, welche eindeutig zwischen den drei bekannten Strukturklassen positioniert sind nicht nur phylogenetisch, sondern auch weil sie tatsächlich intermediäre enzymatische Eigenschaften besitzen. Wir haben die hybrid B Häm Peroxidase Familie für unsere detaillierte biochemische und biophysikalische Untersuchungen ausgewählt. Diese Proteinfamilie kommt nur in verschiedensten Pilzen vor. Es ist auch wichtig zu erwähnen, daß mehrere Gen-paraloge von hyBpox Genen erscheinen am meisten in Genomen von verschiedenen phytopathogenen Pilzen. Dieser Befund unterstreicht ihre Bedeutung für die Wirt Pathogen Interaktionen, vor allem daß diese extrazelluläre Peroxidasen können in Abwehrmechanismen der pathogenen Pilze gegen den oxidativen (respiratorischen) Burst von Pflanzenwirt invovliert werden. Unsere detaillierte Sequenzanalyse hat gezeigt, daß die meiste hybrid B Peroxidasen sind in Wirklichkeit Fusionsproteine welche die N-terminale Häm Peroxidase Domäne in einer Fusion mit der C-terminalen WSC Zucker-bindenden Domäne(n) besitzen. Diese stellen einen neuen und scheinbar verbreiten Tipp von Lektinen aus Pilzen dar. Wir haben synthetische hyBpox Gene produziert und die rekombinante Proteine in E.coli oder mit grösserem Erfolg in P.pastoris exprimiert. Wir haben danach die gereinigte rekombinante Proteine untersucht mit dem Ziel die Struktur-Funktion Beziehungen dieser neuen Peroxidasen aufzuklären.