Rps15 in der Biogenese der 40S ribosomalen Untereinheit

Die Biogenese von Ribosomen ist eine der zentralen Aktivitäten jeder Zelle, die den Zweck hat, ribosomale RNA und ribosomale Proteine zu funktionellen, translationskompetenten Ribosomen zu assemblieren. Abgesehen von zahlreichen nicht-ribosomalen Faktoren, die in diesen komplexen Prozess involviert sind, der sowohl im Nucleolus, als auch im Nucleoplasma und im Cytoplasma abläuft, sind auch ribosomale Proteine an der Ribosomenbiogenese beteiligt. Innerhalb des Gebiets der Ribosomenbiogenese sind ribosomale Proteine ein besonders interessanter Untersuchungsgegenstand, da Mutationen in ribosomalen Proteinen im Zusammenhang mit Knochenmarkserkrankungen gefunden wurden. Die genauen Funktionen in der Ribosomenbiogenese wurden bisher nur bei wenigen ribosomalen Proteinen näher charakterisiert. Ziel des beantragten Projektes ist die Untersuchung der Funktion von Rps15, einem Protein der kleinen ribosomalen Untereinheit in der Ribosomenbiogenese. Die Experimente werden in der Hefe Saccharomyces cerevisiae durchgeführt werden, die aufgrund der einfachen Kombination von genetischen und biochemischen Methoden zurzeit der bevorzugte und bestuntersuchte Modellorganismus im Gebiet der eukaryontischen Ribosomenbiogenese ist. In Vorversuchen für dieses Projekt konnten wir Rps15 als genetischen Interaktionspartner eines bekannten Ribosomenbiogenesefaktors identifizieren, was ein Hinweis darauf ist, dass Rps15 auch eine Funktion in der Ribosomenbiogenese haben könnte. Unsere derzeitige Arbeitshypothese, die sich von weiteren Vorversuchen sowie der kürzlich publizierten Kristallstruktur einer eukaryontischen 40S Untereinheit ableitet ist, dass Rps15 für Umstrukturierungen in 40S Untereinheiten wichtig ist, die in späten Stadien der 40S-Synthese stattfinden. Im Zuge der Charakterisierung von Rps15 werden wir Mutanten generieren, die wir phänotypisch vor allem in Hinblick auf späte Reifungsschritte der 40S Untereinheit charakterisieren werden. Besonderes Augenmerk werden wir dabei auf strukturelle Unterschiede zwischen mutanten und Wildtyp-40S Untereinheiten richten. Die geplanten Experimente werden neue Einblicke in die Funktionen von Rps15 in der Ribosomenbiogenese geben. Des Weiteren wird die Untersuchung der Rolle von Rps15 in Konformationsänderungen von 40S-Untereinheiten zu einem besseren Verständnis von Strukturänderungen im Verlauf der Ribosomenbiogenese beitragen. Nachdem Rps15 von Hefe bis zum Menschen hochkonserviert ist, könnten die Resultate auch auf das menschliche Ortholog umgelegt werden, was am Ende zu einem besseren Verständnis des Zusammenhangs zwischen Ribosomenbiogenesedefekten und Krankheiten führen könnte.

Ribosomen sind hochkomplexe Nanofabriken, die für die gesamte Proteinproduktion in der Zelle verantwortlich sind. Sie sind aus einer großen und einer kleinen Untereinheit aufgebaut, die jeweils aus ribosomaler RNA und ribosomalen Proteinen zusammengesetzt sind. Thema dieses Projektes war es zu untersuchen, wie Ribosomen in der Zelle hergestellt werden. Die Synthese von Ribosomen ist ein zentraler Prozess für jede sich teilende Zelle, da pro Zellteilung die gesamte Ribosomenpopulation der Zelle (mindestens 100.000 Ribosomen) verdoppelt werden muss. Die Ribosomensynthese beginnt mit dem Zusammenfügen der ribosomalen Proteine mit der ribosomalen RNA zu Ribosomen-Vorläuferpartikeln. Diese durchlaufen einen komplexen Reifungsweg, der durch nicht-ribosomale Reifungsfaktoren koordiniert wird. Man hat beobachtet, dass manche ribosomale Proteine zuerst nur relativ schwach an Ribosomenvorläufer gebunden sind, und ihre Interaktion erst im Zuge der Reifung stabilisiert wird. Der Grund für dieses Phänomen war bisher jedoch nicht bekannt. Ein Beispiel dafür ist Rps3, ein ribosomales Protein der kleinen ribosomalen Untereinheit. Rps3 ist aus zwei globulären Domänen aufgebaut, die durch eine kurze flexible Region getrennt sind. Unsere Resultate weisen darauf hin, dass zuerst nur eine der beiden Domänen (die C-Domäne von Rps3) in die Vorläuferpartikel der kleinen ribosomalen Untereinheit eingebaut wird, während die zweite Domäne (die N-Domäne) aus dem Partikel herausragt. Diese Konformation der N-Domäne wird von dem Assemblierungsfaktor Ltv1 aufrechterhalten, welcher außerdem die Bindestellen der Rps3 N-Domäne in der ribosomalen RNA und dem ribosomalen Protein Rps20 blockiert. Folglich ist die Ablösung von Ltv1 von den Vorläuferpartikeln eine Voraussetzung für den vollständigen Einbau von Rps3. Die Ablösung von Ltv1 findet über einen mehrstufigen Prozess statt: Durch Phosphorylierung von Ltv1 kommt es vermutlich zu einer elektrostatischen Abstoßung. Dann kommt es durch ein Rotieren der Rps3 N-Domäne in deren finale Position und die Ausbildung von Kontakten von Rps3 mit der ribosomalen RNA und dem ribosomalen Protein Rps20 zur endgültigen Ablösung von Ltv1 und der stabilen Inkorporation von Rps3. Dieser schrittweise Einbau von zwei Domänen liefert eine Erklärung, wie die Interaktion von Rps3 mit Ribosomenvorläufern im Zuge der Reifung gefestigt werden kann. Der schrittweise Einbau von einzelnen Domänen könnte ein neues Paradigma für die Inkorporation von ribosomalen Proteinen darstellen.