Co-translationaler mRNA Abbau in Drosophila Zellen

Während der letzten 10 Jahren haben sich dabei miRNAs (kleine nicht-codierende RNAs) als Schlüsselregulatoren etabliert und dabei unser Theorien wie die Genregulation auf post-transkriptioneller Ebene passiert völlig revolutioniert. Es ist bekannt, dass tierische miRNAs ihre Ziel-mRNA binden und deren Translation inhibieren oder ihren Abbau beschleunigen. In dem vorliegenden Projektantrag schlagen wir die Untersuchung der verwobenen Beziehung von mRNA Translation und mRNA Abbau vor, sowie dessen Auswirkung auf die miRNA Maschinerie in Drosophila Zellen. Kürzlich haben Studien die Möglichkeit des co-translationalen Abbaues von mRNA in Hefe aufgezeigt. Unsere eigenen Daten in Drosophila Zellen demonstrieren die co-Migration von Faktoren der mRNA Abbaumaschinerie und der miRNA Maschinerie mit Polysomen in Sucrose Gradienten. Daher schlagen wir als erstes die Untersuchung des Abbaues von mRNA an aktiv translatierenden Ribosomen in Drosophila Zellen vor. Zweitens, werden wir den Abbau von mRNAs, welche durch miRNAs inhibiert werden untersuchen. Im Speziellen wollen wir dabei Augenmerk auf den Unterschied zwischen dem translationsabhängigen und translationsunabhängigen Abbau von mRNAs legen. Drittens, werden wir untersuchen wie verbreitet der translationsabhängige Abbau von mRNAs in Drosophilazellen ist. Die Ergebnisse in Drosophila Zellen werden einen wichtigen Beitrag zur Erforschung dieser Regulationswege in höheren Eukaryonten darstellen. Unser langfristiges Ziel ist die Identifizierung von Faktoren, welche die Translationsabhängkeit des Abbaues von mRNA bewirken.

Die Proteinsynthese und der Abbau von Boten-RNAs sind zwei wichtige Schritte in der Kontrolle der Expression von Genen. Die komplexe Regulierung der Genexpression erfolgt durch die Aktivität vieler verschiedener Faktoren u.a. auch kleinen nicht-codierenden RNAs. Es ist bekannt, dass die Proteinsynthese und der Abbau von Boten-RNAs sehr eng gekoppelt sind, unklar ist jedoch wo in der Zelle der Abbau von Boten-RNAs stattfindet. Im Rahmen dieses Forschungsprojektes untersuchten wir die Möglichkeit des Abbaus von Boten-RNAs auf Ribosomen, den Orten der Proteinsynthese. Wir verwendeten Methoden der Affinitätsreinigung um ribosomale Komplexe aus Lysaten von Zellen der Fruchtfliege aufzureinigen. In weiterer Folge konnten wir von den ribosomalen Komplexen Boten-RNAs isolieren und jene RNA Anteile anreichern die Abbauprodukte von Boten-RNAs darstellten. Diese Abbauprodukte konnten mittels HiSeq Analyse untersucht werden. Interessanterweise konnten wir dabei feststellen, dass 93 % der Fragmente, von etwa 12.000 unterschiedlichen Boten-RNAs, in gleicher Menge in den Lysaten der Zellen vorlagen wie auf ribosomalen Komplexen. Dies bedeutet, dass der Großteil, der in der Zelle vorhandenen Fragmente von Abbauprodukten der Boten-RNAs auf ribosomalen Komplexen gefunden werden kann. Die Ergebnisse der HiSeq Analyse wurden zusätzlich durch qRT-PCR Analyse von einzelnen Boten-RNAs verifiziert. Unter den analysierten Abbauprodukten befanden sich auch Boten-RNAs, die durch miRNAs reguliert werden könnten. Die Ergebnisse dieses Forschungsprojektes zeigen, dass der Großteil der Abbauprodukte von Boten-RNAs einer Zelle während des Abbaus mit Ribosomen verbunden bleibt. Dies bedeutet in weiterer Folge, dass wir zeigen konnten, dass ein Ort des Abbaus von Boten-RNAs die Ribosomen selbst sind, an denen Boten-RNAs abgeschrieben und Proteine produziert werden.