Die p27-Y88 Phosphorylierung durch BCR-Abl, JAK2 und FLT3 in der Tumorentstehung

Phosphorylierung des CDK-Inhibitors p27Kip1 an Tyrosinresten hat sich in den vergangenen Jahren als eine wichtige Modifikation manifestiert, welche einen wesentlichen Einfluss auf Funktion und Stabilität des Proteins ausüben kann (Chu et al., 2007; Chu et al., 2008; Grimmler et al., 2007; James et al., 2008; Kardinal et al., 2006). Die Phosphorylierung am Tyrosinrest 88 (Y88) vermindert die CDK-inhibitorische Aktivität von p27, ohne die Bindung an CDK / Cyclin Komplexe zu verhindern. Strukturell beruht das auf einer teilweisen Entfaltung des Proteins von der CDK Untereinheit, die dann das Binden von ATP an die Kinase ermöglicht. p27 wird zudem zum Substrat der gebundenen Kinase. Die zweite Phosphorylierung durch CDK2 ermöglicht der Ubiquitin-Ligase SCF- Skp2 die Ubiquitinierung von p27 und kann so das Protein destabilisieren (Grimmler et al., 2007). Unterschiedliche Tyrosinkinasen (BCR-Abl, Lyn, cSrc und JAK2) können p27 phosphorylieren (Chu et al., 2007; Grimmler et al., 2007; Jäkel et al., 2011). Ein gemeinsames Merkmal dieser Kinasen ist, dass sie in Tumoren aktiviert vorliegen können. Die Expression von BCR-Abl oder JAK2-V617F kann zur verstärkten Phosphorylierung von p27 an Y88 führen, die Stabilität des Proteins vermindern und, in Zellkultur-Zellen, eine vermehrte Zellproliferation hervorrufen. Eine nicht an Y88 phosphorylierbare p27 Mutante p27-Y88F kann die Proliferation in BCR-Abl oder JAK2 exprimierenden Zellkulturzellen effizienter inhibieren als das Wildtyp-Protein (Grimmler et al., 2007; Jäkel et al., 2011). Diese Daten führen zu unserer Arbeitshypothese dass die Phosphorylierung von Y88 durch onkogene Tyrosinkinasen zur Hyperproliferation von Tumorzellen beitragen könnte. Wir planen nun, diese Hypothese mit einem Knock-in Mausmodell zu untersuchen. Dazu haben wir Mäuselinien generiert, bei denen im p27 Gen entweder das Kodon für Y88 oder das alle Tyrosine (Y74, Y88 und Y89) zu Phenylalaninkodon(s) mutiert wurden. Wir möchten nun untersuchen, ob diese p27 Allele die Tumorentstehung in Mäusen verzögern oder verhindern können, wenn diese Tumoren durch die Expression aktivierter Tyrosinkinasen ausgelöst werden. Dazu werden Mausmodelle eingesetzt, die Tumoren durch Expression aktivierter Kinasen induzieren, von denen bekannt ist, dass sie zur Y88-Phosphorylierung von p27 führen. Neben BCR-Abl und JAK2-V617F ist das FLT3-ITD, die erste Rezeptor-Tyrosinkinase, von der wir beobachtet haben, dass ihre Expression zu einer Phosphoryliering von Y88 in p27 führen kann (Ines Peschel und L.H., unpubliziert). In einem zweiten Teil des vorgeschlagenen Projektes möchten wir die Interaktionen von JAK2 und FLT3 mit p27 näher untersuchen. Diese Analysen sollten zu einem besseren Verständnis der physiologischen und pathophysilogischen Funktionen dieser neuen Pathways beitragen.

Die ungebremste und unkontrollierte Vermehrung von Zellen spielt beim Entstehen von Erkrankungen wie zum Beispiel Tumoren eine zentrale Rolle. Zellteilungen werden von einer komplexen Maschinerie reguliert und angetrieben. Diese Maschinerie wird von sogenannten Cyclin-abhängige Kinasen (CDKs) beherrscht. Wenn Zellteilungen erforderlich werden, müssen CDKs aktiviert werden. Zur Verhinderung überschüssiger Teilungen müssen sie später wieder inaktiviert werden. Eine molekulare Bremse, die CDKs inaktivieren und so Zellteilungen verhindern kann ist das CDK-inhibitorische Protein p27Kip1. Dieses Protein wird inaktiviert und abgebaut, wenn Zellen zur Teilung stimuliert werden. Wir haben einen Mechanismus entdeckt, der diese Inaktivierung und den Abbau von p27 auslösen kann. Er ist zur Aufrechterhaltung der Körperfunktion und Regeneration notwendig, wird aber bei bestimmten Tumorerkrankungen kontinuierlich ausgelöst und führt so zu überschüssigen Zellteilungen. Im Rahmen des Projektes haben wir mit dem Protein FLT3 einen neuen Auslöser dieses Mechanismus identifiziert. FLT3 steuert im Gesunden die Bildung von Lymphozyten. Wir haben beobachtet, dass aktiviertes FLT3 die Teilung von Zellen unter anderem durch Inaktivierung von p27 stimulieren kann. Bei einer aus menschlichem Tumormaterial identifizierten Mutation von FLT3 zum aktiven FLT3-ITD wird dieser Weg kontinuierlich aktiviert, was zur verstärkten Teilung der betroffenen Zellen führt. Eine solche Aktivierung von FLT3 erfolgt häufig in PatientInnen mit akuter myeloischer Leukämie (AML). Wir konnten nun die Veränderung und Inaktivierung von p27 durch FLT3 in Zellen aus dem Blut von AML PatientInnen nachweisen und zeigen, dass ein Wirkstoff, der derzeit klinisch als AML Medikament getestet wird, diese Veränderung unterbinden kann. Langfristig könnte dieser Nachweis genutzt werden, um vorab zu klären, ob PatientInnen auf das Medikament ansprechen werden.Um die Rolle der Veränderung von p27 besser zu verstehen, haben wir auch ein Modell entwickelt, in dem das p27 Protein durch den Austausch einer einzigen Aminosäure resistent gegen diese Inaktivierung werden kann. Überraschenderweise haben wir gefunden, dass diese kleine Veränderung einer von 198 Aminosäuren in dem Modellsystem nun von Vorneherein nur sehr schwach exprimiert wird. Anstelle einer verlangsamten Tumorentstehung haben wir sogar ein beschleunigtes Entstehen von Tumoren beobachtet. Die molekularen Hintergründe für diese überraschenden Ergebnisse werden derzeit von uns weiter entschlüsselt. Die generelle Verminderung der p27 Menge deutet auf einen neuen Abbauweg von p27 hin, der selbst zum Entstehen von Tumoren beitragen könnte. Daher ist die Entschlüsselung dieses neuen Wegs ein wichtiger Bestandteil unserer zukünftigen Arbeit.