Struktur und Funktion der picornaviralen Proteasen Lb und 2A

Viren sind ausschließlich intrazelluläre Parasiten. Um eine Zelle für ihre eigenen Zwecke zu verwenden, exprimieren sie Proteine, die mit jenen der Wirtszelle wechselwirken. Auch Viren der Familie Picornavirus stellen Proteine her, die in die Proteinsynthese der infizierten Zelle eingreifen. Die viralen Proteine könnten auch die Transkription von Genen, die für Stressantwortproteine kodieren, beeinflussen und das System der Deubiquitinierung untergraben. Dieses Projekt setzt unsere Untersuchung von zwei solchen Proteinen fort, nämlich der Leader Proteinase (L pro ) vom Maul-und-Klauen Seuche Virus (MKSV) und der 2A Proteinase (2Apro ) von Enteroviren (zB wie Poliovirus). Beide Proteinasen hindern die infizierte Zelle daran, die eigene mRNA zu übersetzen, während die virale Proteinsynthese intakt bleibt. Die Inhibition dieser Enzyme vermindert die virale Ausbeute, sodass Verbindungen, die spezifisch für diese Enzyme sind, die jeweiligen Krankheiten verhindern oder mildern könnten. In diesem Projekt wollen wir die Wechselwirkung zwischen der MKSV Lpro und einem im vorherigen Projekt entwickelten wirksamen Inhibitor untersuchen. Der Inhibitor ist eine Epoxidverbindung mit Aminosäuren, die von der Substratbindungstelle der Lpro erkannt werden. Wir wollen die Struktur des Inhibitor/L pro Komplex mittels Röntgen-Kristallographie und NMR untersuchen. Diese Ergebnisse werden uns einerseits helfen zu verstehen, wie Lpro mit seinem Substrat wechselwirkt und andererseits wie der Inhibitor verbessert werden kann. Weiters werden wir NMR einsetzen, um zu untersuchen, wie Lpro mit einem kleinen Fragment von "eukaryotic initations faktor" (eIF) 4GII wechselwirkt. Diese Ergebnisse sollen uns helfen, zu erklären, warum dieses Molekül effizient von Lpro gespalten werden kann, obwohl die Spaltstelle selbst auf einem Peptid nicht gut erkannt wird. Weiters werden wir einen aktuellen Bericht über eine Deubiquitinase-Aktivität der Lpro prüfen. Es gibt derzeit keine Information über die Strukturen bei der Wechselwirkung des 2A pro Enzyms mit dem cis oder trans Substrat. Deshalb wissen wir wenig darüber, wie diese Enzyme ihre Substrate binden. Das wollen wir für die 2Apro von einem humanen Rhinovirus, einem Poliovirus und einem Coxsackievirus herausfinden. Als Erstes werden wir ausgewählte 2Apro mit einem kurzen daran gebundenen Stück VP1 exprimieren, reinigen und kristallisieren. Falls erfolgreich, werden wir so die Struktur der cis Wechselwirkung zwischen Enzym und Substrat bekommen. Zweitens werden wir versuchen, mehrere 2Apro mit einem Peptid von der Polyproteinspaltstelle oder der eIF4GII Stelle zu kristallisieren, um Information über die trans Wechselwirkung zu erhalten. Drittens wird versucht, Kristalle der 2Apro mit Inhibitoren wie Antipain, Chymostatin und Elastatinal zu generieren; sie hemmen die 2Apro im micromolaren Bereich. Mit solchen strukturellen Informationen sollte es möglich sein, einen wirksamen und spezifischen 2Apro Inhibitor zu entwickeln.

Die Familie der Picornaviren umfasst wichtige Human- und Tierpathogene wie Poliovirus (PV), humanes Rhinovirus (HRV), Coxsackievirus (CV) und das Maul-und Klauenseuche-Virus (MKSV). Bisher konnten PV und MKSV erfolgreich durch Impfstoffe eingedämmt werden; gegen HRV und CV gibt es keinen Impfstoff. Weiters sind Impfstoffe gegen MKSV nur unter bestimmten Bedingungen einsetzbar. Des Weiteren werden PV-Impfstoffe ohne zusätzliche Unterstützung durch antivirale Substanzen möglicherweise nicht in der Lage sein, PV auszurotten. Hier wurden zwei antivirale Kandidaten untersucht: die Proteinase 2Apro von PV, HRV und CV und die Leader Proteinase (Lpro) von MKSV. Das Projekt hatte zwei Hauptziele. Einerseits sollte untersucht werden, wie die 2Apro und Lpro an das zelluläre Protein "eukaryontischer Initiationsfaktor 4G (eIF4G)" binden. Diese Bindung führt anschließend zur Spaltung des Wirtsproteins, wobei der Mechanismus der Spaltung ist zurzeit noch unklar ist. Wir stellten ein entsprechendes Fragment des eIF4G Proteins her und ordneten NMR-Signale für 90% der Aminosäuren zu. Wir konnten zeigen, dass die Wechselwirkung der beiden Proteinasen mit eIF4G allein nicht ausreicht, um einen stabilen Komplex zu bilden. Stattdessen wird ein stabiler Komplex und somit eine effiziente Spaltung nur durch ein zweites zelluläres Protein, eIF4E, möglich. Überraschenderweise fanden wir, dass sowohl die Lpro und die 2Apro spezifisch mit beiden Wirtsfaktoren wechselwirken. Weiters sind diese Wechselwirkungen der HRV und CV 2Apro unterschiedlich, was Auswirkungen auf die Gestaltung von Inhibitoren des PV-Enzyms hat.Das zweite Hauptziel war es, den Mechanismus und die Spezifität des Enzyms Lpro zu verstehen. Dieses Enzym besitzt 30% weniger Aminosäuren als Papain, das prototypische zelluläre Enzym der gleichen Familie. Jedoch kann Lpro C-terminale Selbstprozessierung durchführen und ist des Weiteren viel spezifischer als Papain. Wir wollten die Substratbindung von Papain und Lpro vergleichen. Wir waren in der Lage, die Struktur der Lpro, die kovalent an einen spezifischen Inhibitor gebunden war, aufzuklären. Die Struktur zeigte, dass Lpro Substrate über einen breiteren Bereich von Aminosäuren erkennt als der Prototyp Papain. Zusätzlich muss die Säure/Base-Zusammensetzung des Substrats komplementär zu der der Lpro sein. Auf diese Weise bekommen nur wenige, spezifische Proteine Zugriff auf das aktive Zentrum der Lpro und können somit effizient gespalten werden. Ein solches Protein ist das zelluläre Protein eIF4G.Zusammen erklären die Ergebnisse, warum die Replikation des FMDV so schnell ablaufen kann. Nach der Synthese am Ribosom spaltet die Lpro sich selbst vom wachsenden viralen Protein ab und bindet an eIF4G und eIF4E, die auf dem Ribosom lokalisiert sind. Durch Spaltung von eIF4G wird anschließend die Translation von Host-mRNAs unterbrochen, was die angeborene Immunantwort der Zelle unterdrückt. Die Proteinsynthese auf der viralen RNA ist nicht betroffen, weil sie einen eIF4G-unabhängigen Mechanismus verwendet, um Ribosomen für die Translation zu rekrutieren.