In situ Visualisierung des enzymatischen Zelluloseabbaus

Die enzymatische Hydrolyse von Zellulose ist ein Schlüsselfaktor bei der Produktion von Biotreibstoffen der zweiten Generation, die ein etabliertes Gebiet im Feld der erneuerbaren Energien sind. Trotz einer Fülle an verfügbaren Informationen über Struktur und Funktion der Zellulasen ist der komplizierte Mechanismus mit dem sie ihr komplexes Substrat zerlegen - was der Kern des Problems ist - noch immer nicht bekannt. Das zentrale Ziel in der Entwicklung von Biotreibstoffen ist daher die Überwindung dieser "Widerspenstigkeit" des Substrates. Um die strukturelle Dynamik des enzymatischen Zelluloseabbaus zu untersuchen, nützen wir das Vorhandensein eines unlöslichen Substrates aus: die in situ Visualisierung des enzymatischen Abbaus mittels Rasterkraftmikroskopie (atomic force microscopy, AFM) ist in diesem Fall die Methode der Wahl. AFM weist nicht nur die nötige Auflösung auf, um sogar Einzelenzyme zu beobachten, man kann auch den Effekt, den viele Enzyme auf dem Substrat bewirken, beobachten. Außerdem kann man den enzymatischen Zelluloseabbau beobachten ohne Substrat oder Enzyme zu zerstören und man kann auch unter Flüssigkeit messen [mit Hilfe einer sogenannten Flüssigzelle (liquid cell)]. In einer Vorstudie haben wir die strukturelle Dynamik eines Cellulasekomplettsystems aus Trichoderma reesei auf einer nano-flachen Zellulosepräparation untersucht. Dabei haben wir beobachtet, dass zunächst längliche Fissuren entstehen die sich mit fortschreitendem Substratabbau zu tiefen, konischen Rissen entwickeln. Die Dynamik dieser Oberflächenrisse spiegelt das Zusammenspiel des Abbaus der Substratoberfläche in den Rissen sowie außerhalb dieser wider und es ist gut vorstellbar wie erschwerte Diffusion zu Produktinhibierung und Verlust an kooperativer Interaktion der Enzyme untereinander führt, was die Aktivität der Cellulasen in einem wachsenden Riss zeitweise vermindert. In dem hier vorgeschlagenen Projekt möchten wir den Mechanismus einzelner Cellulasen mit Hilfe von in situ Visualisierung mit AFM aufklären: wie interagieren Cellobiohydrolase I und II und Endoglucanasen mit ihrem Substrat und wie bauen sie es ab? Neben diesen Nicht-komplexierten Systemen werden wir auch den Zelluloseabbau durch bakterielle Cellulosome aus Clostridium thermocellum untersuchen. Weiters interessieren wir uns für die Interaktionen der Zellulosebindedomäne mit dem Substrat. Diese Studie ist durch eine enge Kooperation unseres Labors mit dem Institut für Elektronenmikroscopie (FELMI-ZfE) an der TU Graz möglich. Wir erwarten, dass wir in diesem Projekt grundlegende Fragen klären können: wie verläuft der enzymatische Zelluloseabbau auf einer strukturellen Ebene? Was sind die Rollen der verschiedenen Exo- und Endoenzyme? Welche sind die limitierenden / verlangsamenden Faktoren in der Zellulosehydrolyse und wie können sie überwunden werden? Welcherart ist der Einfluss von Substrateigenschaften (Kristallinität, Mikrostrukturen, sich ändernde Oberfläche, etc.) auf die Cellulaseaktivität? Wie verändert sich ddas Substrat während der Hydrolyse? Dieses Projekt wird wichtige Einblicke in die strukturelle Dynamik der Zelluloseverzuckerung geben. Auf Basis der Ergebnisse können neue Strategien, um die Biotreibstoffproduktion aus Lignozellulose wirtschaftlich zu machen, entwickelt werden.

Der enzymatische Abbau von Zellulose in lösliche und damit leicht verwertbare Zucker ist ein zentraler Schritt in der Nutzung von erneuerbaren Rohstoffen auf Basis von pflanzlicher Biomasse für die Herstellung von Biotreibstoffen und Grundchemikalien. Im Hinblick auf die Effizienz und Ökonomie des gesamten Prozesses stellt der Zelluloseabbau einen kritisch limitierenden Faktor dar und ist damit ein Hauptgegenstand für die Forschung und Technologieentwicklung in einem Fachgebiet (Biotechnologie und erneuerbare Energien) von breiter Relevanz. Zellulose ist ein strukturell komplexes, festes Biomaterial, das sich durch ausgeprägte Resistenz gegenüber chemischem oder enzymatischem Abbau auszeichnet. Trotz massiver Anstrengungen in verschiedenen Disziplinen der Forschung über Jahrzehnte sind die mechanistischen Grundlagen der enzymatischen Konversion von Zellulose, teilweise in ihrem Kern, noch unverstanden. Prinzipielle Schwierigkeit der experimentellen Untersuchung der Wirkung von zelluloseabbauenden Enzymen (Zellulasen) liegt in der Tatsache, dass biokatalytische Prozesse an der festen Oberfläche der Zellulose beobachtet und über einen breiten Bereich der Längenskale, von Nano- bis Mikrometern, in Abhängigkeit von der Zeit, also dynamisch, analysiert werden müssen. Die Erlangung eines vertieften holistischen Prozessverständnis ist von großem fundamentalen Interesse und könnte neue Ansätze zur Effizienzsteigerung der enzymatischen Konversion von Zellulose liefern. In diesem FWF Projekt ist es in einem interdisziplinären Ansatz aus den Bereichen der Physik und Biochemie/Biotechnologie gelungen, die Aktivität von Zellulasen an der Oberfläche von Zellulose mittels Rasterkraftmikroskopie teilweise auf dem Niveau der Einzelenzyme zeit- und ortaufgelöst zu visualisieren. Signifikante methodische Entwicklungen betreffend die Substratpräparationen und die dynamische Analyse unter naturnahen Reaktionsbedingungen waren die Voraussetzung zur Untersuchung der relevanten biologischen Fragestellungen. Völlig neue Einblicke in die dynamische Wirkweise von individuellen Zellulasen, alleine und in synergistischer Kombination, an der Oberfläche von Zellulose wurden dabei erhalten. Erstmals konnte die Substratspezifität von pilzlichen Zellulasen hinsichtlich der Morphologie von Zellulose direkt adressiert und gemessen werden. Basierend auf den Daten der zeitaufgelösten Visualisierung wurde ein neuer Ansatz, unter Verwendung sogenannter Zellulärer Automaten, zur Modellierung des enzymatischen Oberflächenabbaus von Zellulose entwickelt und die erfolgreiche Validierung eines Modells gegen das zeit- und ortaufgelöste Experiment erstmals gezeigt. Neben den klassischen Zellulasen, die Zellulose hydrolytisch abbauen, wurden auch oxidativ zelluloseabbauende Enzyme sowie zellulosebindende Proteine ohne katalystische Aktivität im Hinblick auf ihre Fähigkeit, Zellulose an der Oberfläche anzugreifen, erstmals untersucht und dabei völlig neue mechanistische Erkenntnisse gewonnen.