Regulierung angeborener Immunität durch RNA Helicase DDX3X

Das angeborene Immunsystem bietet einen unmittelbaren, evolutionär adaptierten Schutz vor Infektionen. Seine Wirkungsweise beruht auf der Erkennung mikrobenspezifischer molekularer Muster (PAMPs) durch eine Reihe extrazellulärer, membranständiger oder intrazellulärer Rezeptoren. Das Rezeptorsignal wird anschliessend in einer komplexen Abfolge molekularer Interaktionen und enzymatischer Modifikationen in eine dem Mikroorganismus angepasste Immunantwort übersetzt. Dabei spielt die de novo Expression von Genen eine wichtige Rolle. Viele der unmittelbar nach Erkennung eines Mikroorganismus aktivierten Gene kodieren für Cytokine, Polypeptidmediatoren der Immunantwort. Unter diesen Cytokinen befinden sich die Typ I Interferone (IFN-I). IFN-I steuern die angeborene antivirale Immunantwort, spielen aber auch bei der Immunreaktion gegen nichtvirale Pathogene eine wichtige Rolle. Ihre Synthese und Freisetzung gilt als Markenzeichen der angeborenen Immunantwort. In vorausgegeangenen Arbeiten untersuchten wir Signaltransduktionswege von Mustererkennungsrezeptoren, die zur Aktivierung eines IFN-I Gens, dem IFN-beta Gen, führen. Wir konzentrierten uns dabei auf Interaktoren der Protein Kinase TBK1, einer essentiellen Komponente des zum IFN-beta Gen führenden Signaltransduktionswegs. Es gelang eine RNA Helicase der DEAD box Familie, DDX3X, zu identifizieren, die sich als Substrat des TBK1 Enzyms erwies, die Aktivierung des IFN-beta Gens verstärkte und dabei direkt mit dem IFN-beta Promoter interagierte. DDX3X ist daher Komponente der angeborenen Immunantort mit der Fähigkeit die Expression des IFN-beta Gens zu erhöhen, ohne dabei seine Helicasefunktion zu benötigen. Der Wirkmechanismus des DDX3X ist daher ungeklärt und, da ohne Präzedenzfall, wissenschaftliches Neuland. Der von uns vorgelegte Antrag beschreibt Experimente die den Wirkmechanismus des DDX3X aufklären sollen und genaueren Aufschluss über den Umfang der Bedeutung des Moleküls bei der Abwehr mikrobieller Infektionen geben sollen. Um ersteres zu beantworten wollen wir molekulare Interaktionspartner des DDX3X im Zellkern identifizieren. Anhand der Kenentnis dieser Moleküle werden wir ermitteln, wie DDX3X auf die Regulation von Zielgenen Einfluss nimmt. Um die immunologische Bedeutung von DDX3X zu ermitteln werden wir Zellen und Mäuse die kein DDX3X exprimieren mit PAMPs stimulieren oder mit pathogenen Mikroorganismen infizieren. Diese Vorgehensweise erlaubt uns, den Einfluss des DDX3X auf die Immunantwort zu ermitteln. Zusammengefasst soll unser Projekt ein neues und bisher in seinem Wirkmechanismus nicht verstandenes Molekül funktionell charakterisieren und dabei auch die Möglichkeit ausloten, dass die Beeinflussung seiner Aktivität zu einer gezielten Steuerung der angeborenen Immunantwort führt.

Das Projekt beschreibt die Regulation der Gen-Transkription durch die RNA Helicase DDX3X als bedeutende Komponente der antimikrobiellen Immunantwort. Darüber hinaus spielt die Helicase eine wichtige Rolle bei der Entwicklung von Zellen des Immunsystems. Das angeborene Immunsystem bietet unmittelbaren Schutz gegen Infektionen. Es erkennt konservierte mikrobielle Strukturen und reagiert darauf mit Signalen, die im Zellkern zur Neubildung von Genprodukten führen. Zu diesen gehören die Typ I Interferone (IFN-I), wichtigen Mediatoren sowohl der antiviralen als auch der antibakteriellen Immunität. In vorausgehenden Arbeiten beschrieben wir die DExD/H box RNA Helicase DDX3X als Modulator der Transkription von IFN-I Genen in Zellen die mit dem intrazellulären bakteriellen Pathogen Listeria monocytogenes infiziert waren. Mitglieder der DExD/H box Helicasen erfüllen breit gefächerte Aufgaben im RNA Metabolismus. Darüber hinaus wurde eine stetig steigende Anzahl als Mittler der angeborenen Immunantwort erkannt. Hierbei fungieren sie im Erkennen von Nukleinsäuren, als Signatransduktoren, oder als Regulatoren der Transkription. Die Verstärkung der IFN-I Gen-Transkription fand auch dann noch statt, wenn die Helicaseaktivität des DDX3X durch Mutation eliminiert wurde, was für einen unkonventionellen Wirkmechanismus spricht. DDX3 kommt als zwei Isoformen vor, dem X-chromosomalen DDX3X und dem Y-chromosomalen DDX3Y. Wir zeigen, ihre Funtionen bei essenziellen zellulären Funktionen und auch im angeborenen Immunsystem parziell überlappen. Zusätzlich zu den IFN-I Genen regulieren die DDX3 Isoformen eine Vielzahl antimikrobieller Gene und die Deletion des DDX3X in hematopoietischen Zellen der Maus führt zu einer stark verminderten Immunität gegen L. monocytogenes, hat aber vergleichsweise geringen Einfluss auf Infektionen mit vesicular stomatitis virus. Das Fehlen von DDX3X in haematopoietischen Zellen verursachte eine deutliche Reduktion des Entstehens der lymphoiden Linie. In besonderem Maße waren hiervon die natural killer (NK) Zellen betroffen. Im Einklang hiermit produzierten diese Mäuse nach Infektion mit L. monocytogenes nur geringe Mengen des Interferon? (IFN?). Die rasche Synthese von IFN? durch NK Zellen gilt als wichtiger Schutzmechanismus der angeborenen Immunantwort. Untersuchungen zum Mechanismus der transkriptionellen Regulation durch DDX3X basierten auf Suche nach DDX3X Interaktoren durch Massenspektrometrie. Dieser Ansatz führte zur Identifizierung von Interaktoren, die als Genregulatoren annotiert sind. Insbesondere fanden wir Proteine, die an der Etablierung der Chromatinstruktur oder dem RNA Polymerase II Transkriptionscyclus beteiligt sind. Hierauf basierend vermuten wir, dass DDX3X Geneaktivität durch Änderungen der Chromatinstruktur oder durch einen Einfluss auf transkriptionelle Initiation und Elongation durch RNA Polymerase II moduliert