Lactobacillus buchneri Cell Wall Glycobiology

Lactobacillus buchneri CD034 ist ein Gram-positives, aus Silagematerial isoliertes Milchsäurebakterium mit GRAS (generally regarded as safe)-Status. Auf Grund seiner daraus resultierenden Einsatzmöglichkeit im Lebensmittelbereich ist L. buchneri ein idealer Kandidat für in vivo cell surface display von biofunktionellen Komponenten. Zur Etablierung von L. buchneri CD034 als System für cell surface display ist es notwendig, seine Zelloberfläche und Zellwand auf biochemischer und molekularer Ebene zu charakterisieren. Voruntersuchungen haben gezeigt, dass L. buchneri CD034 vollständig mit einer 2D-kristallinen Zelloberflächenschicht (S-Schicht) bedeckt ist. Die diese S-Schicht aufbauenden Proteine scheinen durch kovalent gebundene Zuckerketten modifiziert zu sein. Dies wird durch frühere Analysen an einem verwandten L. buchneri-Stamm, bei dem die Struktur der S-Schichtglykane sowie eine Dekapeptid-O-Glykosylierungssequenz ermittelt wurde, bekräftigt. Da in der Aminosäuresequenz des S-Schichtproteins von L. buchneri CD034 die idente Dekapeptidsequenz vorliegt, kann man davon ausgehen, dass auch bei L. buchneri CD034 an dieser Stelle O-Glykane gebunden sind. Dieses Projekt basiert auf der Kenntnis der Genomsequenz und der Verfügbarkeit von molekularen Tools zur genetischen Manipulation des Bakteriums. Beides wird durch eine Kooperation mit dem CD Laboratorium für genetisch veränderte Milchsäurebakterien (Prof. Dr. Reingard Grabherr) in das Projekt eingebracht. Konkret sollen drei Themenschwerpunkte bearbeitet werden. (1.) Strukturelle Charakterisierung des S-Schicht-Glykans von L. buchneri CD034 und, basierend auf einer ersten Annotierung Kohlenhydrat-aktiver Enzyme, funktionelle Analyse von Schlüsselenzymen für die Biosynthese der S-Schichtglykane. Derartige Untersuchungen wurden bisher an Milchsäurebakterien nicht durchgeführt. Der Funktionsnachweis von Schlüsselenzymen der S- Schichtglykosylierung ist entscheidend für das geplante proof of principle eines L. buchneri CD034 cell surface display Systems durch glycosylation engineering. (2.) Untersuchung der Bindung des 2D S-Schichtglykoprotein- Gitters (SGP) an die Zellwand von L. buchneri CD034. Dies ist vor dem Hintergrund zu betrachten, dass es bei Milchsäurebakterien bisher keine diesbezüglichen Modelle gibt. Neben klassischen sekundären Zellwandpolymeren (SCWPs) wie Teichon- oder Lipoteichonsäuren wird auch die Einbindung von neutralen Glykanen/Glykoproteinen als Verankerungsstruktur diskutiert. Es soll hier der SGP / SCWP-Komplex von L. buchneri CD034 isoliert und charakterisiert werden. Aus diesen Untersuchungsergebnissen sind erstmals Informationen über die in vivo- Wechselwirkung eines S-Schichtglykoproteins mit seiner Verankerungsstruktur zu erwarten. (3.) Analyse einer möglichen Exopolysaccharid (EPS)-Produktion von L. buchneri CD034 einschließlich der dafür notwendigen genetischen Information. Abhängig vom Vorhandensein an der Zelloberfläche kann es für konkrete cell surface display Applikationen notwendig sein, die EPS-Produktion genetisch auszuschalten, um die Zugängigkeit der biofunktionellen Epitope zu gewährleisten. Insgesamt soll mit diesem GRAS-Organismus das Anwendungspotenzial von biofunktionalisierten S- Schichtglykoproteinen entscheidend erweitert werden.

Die Ziele des kürzlich abgeschlossenen Forschungsprojekts P24305-B20 waren die strukturelle und funktionelle Charakterisierung von ausgewählten Zelloberflächen-Komponenten von Lactobacillus buchneri CD034, die eine wichtige Rolle bei der Wechselwirkung mit der Umgebung spielen. Dieser Stamm ist ein Gram-positives, aus Silagematerial isoliertes Milchsäurebakterium mit GRAS (generally regarded as safe)-Status. Auf Grund seiner daraus resultierenden Einsatzmöglichkeit im Lebensmittelbereich ist L. buchneri CD034 ein idealer Kandidat für in vivo cell surface display von biofunktionellen Komponenten. Zur Etablierung des cell surface display Systems war es notwendig, die Zelloberfläche und Zellwand auf biochemischer und molekularer Ebene zu charakterisieren.Konkret wurden im Projekt vier Themenschwerpunkte bearbeitet: (1) Strukturelle Charakterisierung des S-Schicht-Glykans von L. buchneri CD034. Voruntersuchungen hatten gezeigt, dass dieser Stamm vollständig mit einer 2D-kristallinen Zelloberflächenschicht (S-Schicht) bedeckt ist. An einer definierten Dekapeptid-O-Glykosylierungssequenz des S-Schichtproteins wurden kurze, aus Glucose aufgebaute Zuckerketten gefunden, die O-glykosidisch am Protein verankert sind. Damit wurden auch frühere Analysen an einem verwandten L. buchneri-Stamm bestätigt. (2) Untersuchungen zur Bindung des S-Schichtglykoprotein (SGP)-Gitters an die Zellwand von L. buchneri CD034. Bisher gab es dazu für Milchsäurebakterien keine allgemein gültigen Modelle. Neben den klassischen sekundären Zellwandpolymeren (SCWPs) wie Teichon- oder Lipoteichonsäuren wurden auch neutrale Glykane/Glykoproteine als Verankerungsstruktur diskutiert. Um diese Frage zu klären, wurde der SGP/SCWP-Komplex von L. buchneri CD034 isoliert und erstmals die in vivo-Wechselwirkung zwischen SGP, SCWP und Peptidoglykan als Verankerungsmatrix mittels single molecule force spectroscopy bestimmt. (3) Analyse einer möglichen Exopolysaccharid (EPS)-Produktion von L. buchneri CD034. Die elektronenmikroskopische Untersuchung von Zellen ergab keinen direkten Hinweis auf das Vorkommen von EPS, obwohl im Genom ein Abschnitt gefunden wurde, der auf die Synthese eines bisher nicht identifizierten Glykans hindeutet; weitere Untersuchungen sind nötig. (4) Mit dem GRAS-Organismus L. buchneri CD034 wurde das Anwendungspotenzial von biofunktionalisierten S-Schichten bedeutend erweitert. Mit dessen S-Schicht als Trägermatrix für ein Peptid des Erdnussallergens Ara h 2 wurde eine Modellvakzine für eine Erdnussallergen-spezifische Immuntherapie hergestellt und in einem ersten Ansatz immunologisch erfolgreich getestet.Um unser allgemeines Verständnis der prokaryotischen Protein-Glykosylierung für Glycan Engineering-Anwendungen zu erweitern, wurden in Nebenprojekten auch spezifische Glykosylierungsaspekte von anderen bisher nicht (vollständig) bekannten S-Schicht-Systemen von ausgewählten Bakterien und Archaeen untersucht.