Identifizierung eines neuen posttranskriptionellen regulatorischen Elements

Post-transkriptionelle Regulation (PTR) der Genexpression ist ein wichtiger Mechanismus für die Kontrolle der Expression, sowohl zellulärer, als auch viraler, Gene. Einige Schlüsselerkenntnisse zur PTR der Genexpression wurden am Retrovirusmodell gemacht. Der Schwerpunkt dieser Studie liegt auf der PTR eines komplexen murinen Beta-Retrovirus, dem Murinen Mammatumor-Virus (MMTV). MMTV kodiert für ein Rev-ähnliches Protein, Rem, welches an das Rem-responsive Element (RmRE) bindet und den Export intron-hältiger viraler RNA aus dem Kern bewirkt. Im Gegensatz zu anderen komplexen Retroviren, wie etwa HIV-1, scheint das akzessorische Protein nicht für den Nukleus-Export von teilweise gespleißter env mRNA notwendig zu sein. Wir schlagen stattdessen eine Alternative vor, in der die Anhäufung der MMTV RNA im Cytoplasma von einem am 5`-Ende lokalisierten cis- aktiven Element (vorläufig als MPPE bezeichnet) vermittelt wird. Dieses Konzept wird unterstützt von kürzlich gemachten Beobachtungen, wonach i) die Deletion des MPPE (im Gegensatz zu RmRE) aus Env-subgenomischen Expressionkonstrukten zum Verlust von env mRNA im Zytoplasma transfizierter Zellen führt und ii) die Insertion des MPPE in ein HIV-1 gag/PR-Reporterkonstrukt der Aktivität inhibitorischer Signale, die für die Anhäufung der HIV-1 gag/PR-mRNA im Kern verantwortlich ist, entgegenwirkt und effiziente Lokalisation des Transkripts im Cytoplasma erlaubt. Strukturvorhersagen für MPPE beschreiben eine Faltung in eine lange "stem loop"-Struktur am 5`UTR/env(rem)-Übergang. Die generelle Anordnung von MPPE erinnert an das "constitutive transport element" (CTE), das für MPMV beschrieben wurde, und bestärkt die Wichtigkeit dieser Sequenz. Im Gegensatz zum CTE bindet das MPPE nicht direkt an Tap, den wichtigsten Kernexportrezeptor. Unsere Anstrengungen, MPPE-bindende Faktoren zu isolieren, resultierten in der Identifikation zweier zellulärer Proteine, die eine konservierte Kälteschock-Proteindomäne enthalten: Y-Box binding protein (YB-1) und DNA-binding protein A (DBPA). Diese Proteine sind multifunktionelle Proteine, die mit DNA/RNA interagieren, zwischen Nukleus und Cytoplasma wechseln und die Expression verschiedener Gene beeinflussen können. Das Ziel unseres Projektes ist es, die vorläufigen Daten zu konsolidieren und auszuweiten um das Modell zu bestätigen, wonach zwei unterschiedliche RNA-Elemente für die zytoplasmatische Anhäufung von MMTV-Transkripten verantwortlich sind. Im Laufe des Projektes werden wir zusätzliche Einsichten in die Abläufe der MPPE-abhängigen Verstärkung der Genexpression erhalten. Funktionelle Grenzen werden definiert werden, und die parallele Analyse von RNA-Strukturen (PARS) zur genaueren Bestimmung des M-fold-basierten MPPE Konformationsmodells soll durchgeführt werden. Desweiteren soll die Rolle der an GC-reiche Elemente bindenden Proteine YB-1 und DBPA im Hinblick auf die PTR der Expression von MMTV und zellulären Genen untersucht werden. Die Lokalisation des MPPE am 5`-Ende spiegelt die Position eines kürzlich beschriebenen Kernexportelementes wieder, welches die Anhäufung von Transkripten sekretorischer Proteine im Zytoplasma bewirkt. Ein zellulärer RNA-Export-Adaptor dafür konnte bis jetzt nicht identifiziert werden. Da dieser Faktor DNA-Abschnitte, die arm an Adenin sind erkennen sollte, und YB-1 GC-reiche Abschnitte favorisiert, scheint es sinnvoll anzunehmen, daß die Kälteschockdomänen beinhaltenden Protein diese Adaptoren darstellen könnten, und mit den Signalsequenz kodierenden Abschnitten interagieren und somit Kernexport von mRNAs sekretorischer Proteine bewirken können. Zusammenfassend betrachtet glauben wir, daß das vorgeschlagene Projekt neue Aspekte der post-transkriptioneller Regulation von Genexpression aufzeigen kann. Das neu gewonnene Wissen könnte auch für zukünftige Anwendungen, wie der Verbesserung von Gentherapievektoren und Expressionsplasmiden, von Bedeutung sein.

Retroviren als Modellorganismus haben in der Vergangenheit schon mehrfach zu einem besseren Verständnis beigetragen, wie zelluläre RNA Moleküle vom Nukleus in das Zytoplasma der Zelle exportiert werden. Tatsächlich wurden zwei der wichtigsten mRNA-Export-Rezeptoren (Tap/NXF1; CRM1) und ihre Signalwege durch retrovirale Modellorganismen wie HIV-1 und MPMV entdeckt. Genau wie retrovirale RNAs, müssen auch zelluläre mRNAs den Nukleus verlassen um an ihrer finalen Destination angekommen, in Proteine translatiert zu werden. Bevor sie aber den Nukleus verlassen, werden die meisten primären zellulären Transkripte alternativ gespleißt um eine Vielzahl an alternativen Varianten eines Gens bereitzustellen, von denen einige Introns enthalten. Auf welche Art intron-enthaltende Spleißvarianten die zellulären Überwachungsmechanismen, welche den Export unvollständig gespleißter mRNA verhindern sollen, überwinden , ist bisher unklar.In der vorliegenden Arbeit berichten wir unsere Ergebnisse wie ein Retrovirus, Mouse Mammary Tumor Virus (MMTV), den Spleißvorgang nutzt um ein potentes RNA-Element zu formen, das den Export einer intron-tragenden einfach gespleißten RNA aus dem Nukleus ermöglicht. Konkret resultiert die Juxtaposition zweier benachbarter Exons durch spleißen in der Ausbildung eines RNA-Elements, welches in seiner Struktur an das "constitutive transport element (CTE)" von MPMV erinnert. Das als MPPE bezeichnete RNA-Element konnte durch computergestützte Strukturvorhersage mithilfe des mfold-Algorithmus in Kombination mit Nuklease S1-Kartierung mit nachfolgendem "deep sequencing" als hoch strukturiert charakterisiert werden. Das Vorhandensein des Elementes am 5' Ende der einfach gespleiten env mRNA überschreibt den Effekt des CRM1 Exportsignals am 3' Ende des Transkripts und vermittelt die CRM1 unabhängige Translokation der RNA vom Nukleus in das Zytoplasma der Zelle. Ein neu entwickeltes GFP-basiertes Reporterassay für nukleären Export zeigt darüber hinaus das MPPE nicht nur ein potentes RNA Element ist, sondern CTE und RRE/Rev basierte Exportsignale in seiner Aktivität noch übertrifft. Darüber hinaus kann das Reporter-Assay auch für die genomweite Identifikation ähnlicher RNA-Exportelemente herangezogen werden. Tatsächlich konnte durch Klonierung einer Bibliothek von 400nt langen zellulären RNA-Fragmenten in den Reporter ein Anstieg der GFP-Fluoreszenz, ähnlich wie bei MPPE festgestellt werden. Die Identifikation jener RNA Elemente in der Bibliothek, welche den nukleären Export der GFP mRNA und damit verbundenen Anstieg der GFP-Expression hervorrufen ist in Arbeit.Zusammenfassend zeigen wir in dieser Arbeit erstmalig das i) eine einzelne virale mRNA zwei distinkte RNA-Export-Elemente enthält; ii) die Juxtaposition zweier Exons eine RNA-Exportaktivität erzeugen kann ; iii) Spleißing potentere Export Elemente hervorbringen kann, als bisher bekannt; iv) ein neues GFP-basiertes Reporter Assay zur genomweiten Identifikation von zellulären cis-wirkenden Export Elementen dienen kann.Die hier vorliegende Arbeit ebnet den Weg für ein besseres Verständnis dafür, wie alternatives Spleißen reguliert wird.