Analyse des Phosphoproteoms während der Entwicklung der neuromuskulären Synapse

Proteinphosphorylierung reguliert unterschiedliche zelluläre Prozesse und steuert dadurch entwicklungsbiologische Vorgänge, deren Deregulierung zu Missbildungen und Krankheit führen können. Unter anderem wird auch die Bildung der neuromuskulären Synapse durch Proteinphosphorylierung und den daraus resultierenden Siegnalkaskaden bestimmt. Die neuromuskuläre Synapse ist die spezialisierte Verbindungsstelle zwischen einem Motorneuron und einer Muskelfaser. Diese Synapsen regulieren jede Art der Bewegung inklusive Atmung innerhalb eines Organismus. Innerhalb dieses Projektes wollen wir die Phosphorylierung als regulatorischen Mechanismus während der Entstehung der neuromuskulären Synapse untersuchen. Hauptfokus dieser Arbeit wird die Identifizierung von neuen Phosphorylierungsereignissen und deren Charakterisierung darstellen. Wir erwarten uns dadurch neue Erkenntnisse über die molekularen Mechanismen, die zur Bildung einer funktionellen neuromuskuläre Synapse führen und wir hoffen, zur Verbesserung der Diagnose und Behandlung von kongenitalen Myasthenie-Syndromen bei zu tragen.

Synapsen sind essentielle Schaltstellen des zentralen und peripheren Nervensystems, die Informationen zwischen verschiedenen Zellen weiterleiten. Die neuromuskuläre Synapse ist die spezialisierte Verbindungsstelle zwischen einem Motorneuron und einer Muskelfaser. Diese Synapsen regulieren jede Art der Bewegung innerhalb eines Organismus. Das Ziel unserer Forschungsarbeiten konzentriert sich auf die Analyse der molekularen Vorgänge, die zur Bildung der neuromuskulären Synapse führen. Sobald Motorneuronen mit Muskelfasern interagieren, findet ein Austausch von Signalen zwischen Muskel und Nerv statt und die Bildung einer neuromuskulären Synapse mit einer differenzierten präsynaptischen Nervenendigung und einem spezialisierten postsynaptischen Apparatus wird initiiert. An der postsynaptischen Muskelmembran kontrolliert eine Kinase, genannt MuSK, die Signalwege, die für die Entstehung der neuromuskulären Synapse wichtig sind. Unter anderem wird die Aktivität von MuSK durch posttranslationale Modifikationen reguliert. Die bekannteste davon ist Phosphorylierung. Das Anhängen von Phosphatresten an bestimmte Aminosäuren in MuSK wirkt induzierend auf die Aktivität von MuSK und die darunter liegenden Signalwege. Um die phosphoproteomischen Zusammenhänge von MuSK Signalen zu untersuchen und identifizieren, wurde ein globaler und quantitativer Ansatz mittels Massenspektrometrie gewählt. Wir detektierten eine Anreicherung regulierter Phosphoproteine, welche eine Rolle bei posttranskriptionalen Mechanismen und zytoskelettaler Organisation spielen. Aufgrund der unverzichtbaren Rolle des Zytoskeletts bei dem Clustering von Acetylcholinrezeptoren wurde der zytoskelettale Regulator Palladin für weitere Studien identifiziert. Palladin existiert in mehreren Isoformen, welche während der Muskeldifferenzierung spezifisch hoch- oder runterreguliert werden. RNAi-vermittelte Blockade der Palladin Expression in differenzierten Myotuben zeigte, dass Palladin als Modulator postsynaptischer Differenzierung fungiert. Außerdem wurde eine neue Phosphoserin-Stelle (S751) entdeckt, welche während der späten Agrin Stimulation hochreguliert ist. S751 ist Teil der Aktivierungsregion der MuSK Kinasedomäne. Eine phospho-imitierende Mutante von S751 steigert die basale MuSK Kinaseaktivität, AChR Phosphorylierung und AChR Clustergröße. Wir postulieren, dass durch die Phosphorylierung von S751 die Autoinhibierung der Kinasedomäne reduziert wird. Als Konsequenz wird die MuSK Kinaseaktivität erhöht oder stabilisiert. Daher könnte die Phosphorylierung von S751 einen neuartigen Mechanismus zur Modulation der MuSK Kinaseaktivität während der Ausbildung oder Erhaltung der neuromuskulären Synapse darstellen.