Molekulare Charakterisierung von nicht-kanonischer ATM-Signalisierung

ATM ist eine Proteinkinase, welche in der Erkrankung Louis-Bar-Syndrom, auch Ataxia telangiectasia (A-T) genannt, mutiert ist. Die betroffenen Patienten zeigen Immundefizite, Krebsprädispositionen, neuronale Degenration und Strahlenempfindlichkeit. Die molekulare Rolle der ATM besteht darin, auf DNA Doppelstrangbrüche (DSBs) und Veränderungen der Chromatin Struktur durch gezielte Phosphorylierung zu reagieren und somit die Reparatur von DNA Schäden zu fördern oder den Stillstand des Zellzyklus zu initiieren. ATM wird durch 2 bekannte Co-Faktoren in stimulusabhängender Weise aktiviert: nach Induktion von DSBs wird NBS1 (mutiert im Nijmegen- Breakage-Syndrom und Teil des MRN Komplexes) benötigt. ATM kann jedoch auch bei Fehlen von DNA DSBs aktiviert werden. Die Behandlung von kultivierten Zellen mit hypotonischem oder replikativen Stress führt zur Aktivierung der ATM, da diese Agenzien wahrscheinlich eine Änderung der Chromatinstruktur unabhängig von NBS1 bewirken. Erst kürzlich konnten wir ATMIN (ATM INteracteractor) als notwendig für die ATM Funktion nach replikativen/hypertonischen Stress identifizieren. Wir konnten zeigen, dass nicht-kanonische ATM-Signalisierung durch ATMIN für die ATM Funktion in B-Zellen während der Reifung, bei der Klassenwechselrekombination als auch bei der Suppression der Lymphomagenese benötigt wird. Diese Daten zeigen, dass ATMIN-vermittelte ATM Aktivierung von physiologischer Relevanz in somatischer Rekombination, sowie bei der Erhaltung von genomischer Stabilität ist. In meiner Gruppe habe ich noch unpublizierte Daten, welche zeigen, dass ATMINvermittelte ATM Aktivierung essentiell für die Lokalisierung des ATM Substrates 53BP1 in dem sogenannten "53BP1 enthaltenden Schutz Komplexes" (53PC) ist. Wir nehmen an, dass ATMIN eine Rolle im Aufbau des 53PC von unter - replizierter DNA spielt und dass dieser Komplex als Schutzschild für chromosomal-fragile sites dient. Unser Ziel ist es den molekularen Mechanismus von ATMIN in diesem nicht-kanonischen ATM-Signalisierungspfad zu verstehen. Darüber hinaus nehmen wir an, dass ATMIN an fragile Seiten innerhalb des Genoms bindet, und somit mit 53BP1 co-lokalisiert. Wir verfolgen deshalb das Ziel diese Regionen des Genoms mit Hilfe von Chromatin- Immunoprezipitation (ChIP) und ChIP Sequenzierung zu identifizieren. Zusätzlich vermuten wir, dass andere, neuartige Proteine für die ATM Aktivierung und 53BP1 Lokalisierung nach replikativem Stress involviert sind. Um diese Proteine identifizieren zu können, habe ich einen neuen mikroskop-basierten Ansatz (für aktivierte ATM und 53BP1 Lokalisierung durch Immunfluoreszenz) für einen genomweiten siRNA Libary-Screen verwendet. Dieser Antrag wird uns entscheidend helfen mehr darüber zu verstehen, wie der nichtkanonische ATM- Signalisierungsweg funktioniert. Um dieses Projekt durchführen zu können, beantrage ich eine PostDoc Stelle mit starken Hintergrund in Molekular/Zellbiologie und eine PhD Studentenstelle, welche beide zu 100% für dieses beantragte Projekt angestellt werden sollen.

DNA Replikation ist ein fundamentaler Prozess der Zelle, welcher die präzise Verdoppelung der genetischen Information und die anschließende Übertragung auf Tochterzellen gewährleistet. Unser Ziel innerhalb dieses Projekts war es, diesen Vorgang besser zu verstehen. Durch die Anwendung zellulärer Modelle haben wir gezeigt, dass eine Schlüsselkinase (ATM genannt), verantwortlich für die Signalisierung von DNA Doppelstrangbrüchen, tatsächlich eine Funktion in der Signalisierung von DNA Replikationsstress ausübt. Hierbei benötigt sie einen Ko-faktor (ATMIN genannt), um ihre Substrate zu phosphorylieren und DNA Reparaturproteine an Orte von DNA Schäden zu leiten. Das Resultat ist die Erhaltung genomischer Integrität als Antwort auf Replikationsstress. Aufgrund der Tatsache, dass DNA Doppelstrangbrüche in Lymphozyten generiert werden, leiden Patienten mit Mutationen im ATM Gen an Immunschwäche (nebst anderer Pathologien). Um die Regulation von ATM in T Zellen besser zu verstehen haben wir Mausmodelle generiert, um die Beteiligung von ATMIN und NBS1 an den Funktionen von ATM innerhalb von T Zellen zu bestimmen. Wir haben aufgezeigt, dass die Funktionen von NBS1 innerhalb von T Zellen eigenständig sind, der kombinierte Verlust von ATMIN und NBS1 jedoch zu einer gesteigerten DNA Schädigung führte, was die spontane periphere T Zell Hyperaktivierung, Proliferation sowie exzessive Produktion von entzündungsfördernden Cytokinen und Chemokinen vorantrieb und zu einer höchst entzündlichen Umgebung führte. In vivo führte dies zu einer schweren intestinalen Entzündung, Kolitis und vorzeitigem Tod. Dieses Projekt hat insgesamt zu einem besseren Verständnis von ATM Regulierung, via den Ko-faktoren ATMIN und NBS1, in der Erhaltung genomischer Integrität und in der Unterdrückung von Pathologie geführt.