Mechanismen der Transmitterfreisetzung an GABAergen Synapsen

Die Mechanismen der Transmitterfreisetzung wurden in einer Vielzahl von glutamatergen Synapsen studiert, insbesondere der Held`schen Calyx im auditorischen Hirnstamm. Dagegen ist über die Mechanismen der Transmitterfreisetzung an GABAergen Synapsen nur wenig bekannt. In unseren vorangegangenen Untersuchungen der Ausgangssynapsen von schnellfeuernden, Parvalbumin-exprimierenden GABAergen Interneuronen fanden wir, dass die Kopplungsdistanz zwischen der Ca2+-Quelle und dem Ca2+-Sensor an diesen Synapsen im Nanometer- Bereich liegt und dass die Zahl der offenen Ca2+-Kanäle, die zur Transmitterfreisetzung benötigt werden, gering ist und möglicherweise nur zwei oder drei beträgt. Weiter konnten wir zeigen, dass ein Ca2+-Sensor, der verschieden von Synaptotagmin-1 sein muss, an der schnellen GABA-Freisetzung beteiligt ist. Zusammenfassend legen die Ergebnisse nahe, dass sich die Transmitterfreisetzung an GABAergen Synapsen fundamental von der an glutamatergen Synapsen unterscheidet. Basierend auf diesen überraschenden Vorbefunden wollen wir die Mechanismen der Transmitterfreisetzung an den Ausgangssynapsen verschiedener GABAerger Interneurone im Hippokampus systematisch charakterisieren, mit besonderem Schwerpunkt auf der Kopplung zwischen Ca2+- Kanälen und Ca2+-Sensoren der Exozytose. Um diese wichtige Fragestellung zu verfolgen, werden wir cutting edge elektrophysiologische Techniken (Paarableitungen zwischen synaptisch verbundenen Parvalbumin- Interneuronen bzw. CCK-Interneuronen und ihren Zielzellen), konfokales Imaging, Ca2+-Uncaging, und molekulare Methoden miteinander kombinieren. Folgende Fragen sind zu beantworten: Erstens möchten wir analysieren, wie das kurze Aktionspotential in GABAergen Interneuronen zur dichten Kopplung zwischen Ca2+- Quelle und Ca2+-Sensor beiträgt. Zweitens wollen wir die entwicklungsabhängige Regulation der Kopplungsdistanz zwischen Kanälen und Sensoren an GABAergen Synapsen untersuchen. Drittens werden wir synapsenspezifische Unterschiede in der Kopplungskonfiguration charakterisieren und die zugrundeliegenden zellulären und molekularen Mechanismen analysieren. Viertens werden wir die Affinität und molekulare Identität des Ca2+-Sensors bestimmen, der die GABA-Freisetzung vermittelt und der sich vermutlich von Synaptotagmin 1 unterscheidet. Die Affinität des Sensors wird gemessen, indem gebundenes Ca2+ (DM-Nitrophen) in präsynaptische Terminalien geladen und durch Lichtblitze freigesetzt wird. Die Identität des Ca2+-Sensors wird bestimmt, indem Immunzytochemie und funktionelle Untersuchung von Knockout-Synapsen kombiniert werden. Schließlich wollen wir untersuchen, wie die Kopplung zwischen Kanälen und Sensoren auf molekularer Ebene kontrolliert wird. Insbesondere wollen wir den funktionellen Beitrag dreier präsynaptischer Proteine charakterisieren: der Rab3a-interagierenden Moleküle (RIMs), der Neurexine, und der Septine. Wir erwarten, dass die Ergebnisse ein klares Bild der Mechanismen der Transmitterfreisetzung an GABAergen Synapsen liefern, das langfristig die Detailschärfe früherer Untersuchungen an der Held`schen Calyx erreicht. Die Ergebnisse haben weitreichende Implikationen für das Verständnis der Funktion der Inhibition in neuronalen Netzwerken und der Dysfunktion der Inhibition in neurologischen und psychiatrischen Erkrankungen, bis hin zu hochkomplexen Erkrankungen wie Epilepsie und Schizophrenie.

Inhibitorische Synapsen, die den Überträgerstoff Gamma-Aminobuttersäure (GABA) freisetzen, spielen eine Schlüsselrolle in zahlreichen Funktionen des Gehirns, wie der inhibitorischen Kontrolle der Gehirnaktivität, der rhythmischen Aktivität des Gehirns, und der Musterseparation. Für all diese Funktionen ist die schnelle und effiziente Signalgebung an GABAergen Synapsen von entscheidender Bedeutung. Die zugrundeliegenden molekularen und subzellulären Mechanismen sind jedoch weitgehend unverstanden. Um diese Frage zu adressieren, charakterisierten wir die synaptische Signalübertragung an der sogenannten Korbzell-Purkinjezell Synapse, einer inhibitorischen Schlüsselsynapse im Kleinhirn. Um die synaptische Übertragung auf biophysikalischer Ebene zu studieren, führten wir gleichzeitige Paarableitungen von synaptisch verbunden Zellen durch. Dieser Ansatz erlaubte uns, die Mechanismen der Transmitterfreisetzung mit einer zeitlichen Auflösung im Mikrosekundenbereich zu messen. Wir fanden, dass die Mechanismen der Transmitterfreisetzung an diesen Synapsen sich von denen an exzitatorischen Synapsen in vielerlei Hinsicht unterschieden. Erstens entdeckten wir, dass die präsynaptischen Kalziumkanäle (in der Plasmamembran) und die Transmitterfreisetzungssensoren (in der Membran der synaptischen Vesikel) außergewöhnlich dicht miteinander gekoppelt sind. Die Kopplungsdistanz zwischen den beiden molekularen Elementen betrug lediglich ungefähr 10 Nanometer, wesentlich weniger als an vielen anderen Synapsen. Dichte Kopplung reduziert Verzögerungen durch Diffusion des Kalziums und trägt damit zur schnellen Signalgebung an GABAergen Interneuron-Ausgangssynapsen bei. Zweitens entdeckten wir, dass die Kalziumsensoren der Transmitterfreisetzung an diesen inhibitorischen Synapsen hochgradig spezialisiert sind. Genetische Elimination von Synaptotagmin 2, einem der Kalziumsensorkandidaten, reduzierte die Transmitterfreisetzung nach einzelnen Aktionspotentialen erheblich. Dies identifiziert Synaptotagmin 2 als den dominierenden Kalziumsensor an dieser Synapse. Da Synaptotagmin 2 die schnellste Bindungs- und Dissoziationskinetik von allen Mitgliedern der Synaptotagminfamilie zeigt, haben diese Resultate einen weiteren Mechanismus identifiziert, der zur Geschwindigkeit der inhibitorischen synaptischen Übertragung beiträgt. Drittens haben wir entdeckt, dass Synaptotagmin 7 eine gänzlich unerwartete Rolle in der Regulation der Transmitterfreisetzung spielt. Genetische Elimination von Synaptotagmin 7 hatte keinen Effekt auf die Transmitterfreisetzung nach einzelnen Aktionspotentialen, aber reduzierte erheblich die Transmission während einer Serie von Reizen. Synaptotagmin 7 garantiert daher die Stabilität der inhibitorischen synaptischen Übertragung während einer hochfrequenten Aktivität, wie sie in zerebellären Interneuronen unter in vivo Bedingungen auftreten kann. Schließlich legten unsere Resultate zahlreiche Ähnlichkeiten zwischen GABAergen Synapsen im Kleinhirn und Hippocampus nahe, sodass unsere Schlussfolgerungen generelle Gültigkeit zu besitzen scheinen. Zusammenfassend haben die Resultate aus dem Projekt die Hauptmechanismen identifiziert, die der Geschwindigkeit und Effizienz von GABAergen Synapsen im Gehirn zugrunde liegen. Sie zeigen weiterhin eine Arbeitsteilung zwischen verschiedenen Kalziumsensoren, wobei Synaptotagmin 2 für die Geschwindigkeit und Synaptotagmin 7 für die Aufrechterhaltung der synaptischen Effizienz bei repetitiver Aktivität von Bedeutung ist. Die Ergebnisse wurden hauptsächlich in drei Publikationen veröffentlicht (Arai et al., 2014, eLife; Chen et al., 2017a, Cell Reports; Chen et al., 2017b, Cell Reports). Diese Veröffentlichungen erregten viel Aufsehen bei wissenschaftlichen Veranstaltungen und in öffentlichen Medien. Da zahlreiche neurologische und psychiatrische Krankheiten durch Veränderungen an inhibitorischen Synapsen bedingt sind, haben die vorliegenden Resultate weitreichende Relevanz für das Verständnis von Gehirnerkrankungen und die Entwicklung neuer therapeutischer Strategien.