Synthese von Acinetobacter LPS Liganden für Collectine

Lektine zählen zu wichtigen Komponenten des angeborenen Immunsystems und erkennen vielfältige Kohlenhydratstrukturen an der Oberfläche von pathogenen Bakterien, Viren und Pilzen. Die Gruppe der C- reaktiven Lektine benötigt essentiell Calcium-ionen für die Bindung an OH-Gruppen der Kohlenhydrate. Zu dieser Gruppe zählen unter anderem das Mannose-bindende Protein MBL und die Lungen-Surfactant-Proteine SP-A und SP-D, die eine Sofortreaktion auf unerwünschte Erreger im Serum sowie an der Oberfläche des Lungengewebes induzieren können. Die Bindung an einzelne Kohlenhydrate ist zumeist nur schwach ausgeprägt, wird jedoch durch deren multiple Präsentation an Zelloberflächen massiv verstärkt. Im Zuge von Vorarbeiten hat sich gezeigt, dass bestimmte Bereiche der Zelloberfläche von Acinetobacter mit ungewöhnlich hoher Affinität an das Mannose- bindende Protein binden; die genaue Bindungsregion ist jedoch nicht bekannt. Aus dem Zellwandmaterial der Bakterien können jedoch nur heterogene Kohlenhydratfraktionen in geringer Menge isoliert werden, sodass weiter gehende Untersuchungen über die chemische Synthese der relevanten Kohlenhydratdomänen vorgenommen werden müssen. Als Basis der Syntheseplanung dient die Kernregion des Lipopolysaccharids aus Acinetobacter haemolyticus, einem Vertreter einer Bakteriengattung die als Folge zunehmender Antibiotikaresistenz zu nosokomialen Infektionen bei Patienten führt. Das Projekt beinhaltet die chemische Synthese von Oligosacchariden bis zur Größe von Pentasacchariden mit Einbau einer spezifischen Phosphatgruppe und einer seltenen Zuckersäure Ko (Octulosonsäure), für die neue Synthesewege vorgesehen sind. Für die Glykosidkopplung werden auch neue Donoren des Zuckerbausteins Ko erprobt und die konventionelle Reaktionsführung im Batch-Verfahren mit optimierten Reaktionsbedingungen in kontinuierlichen Durchflussmikroreaktoren verglichen werden. Die hergestellten Modellverbindungen werden sodann für Bindungsstudien mit MBL und SPD eingesetzt und auf Basis dieser Ergebnisse sind weitere Strukturmodifikationen vorgesehen um den miminalen Bindungsbereich der hoch-affinen Wechselwirkung auf molekularer Ebene zu definieren. Die Bindungsstudien und Arbeiten zur Struktur sind gemeinsam mit etablierten internationalen Gruppen aus Deutschland, Kanada und den USA geplant und umfassen Lektinbindungstests, Oberflächen-Plasmon Resonanz und isotherme Mikrokalorimetrie ebenso wie Röntgen-strukturuntersuchungen der Liganden mit MBL, und den Humanen Surfactant Proteinen A und D. Ergänzt werden diese Studien mit molecular modeling und NMR-spektroskopischen Messungen zur näheren Bestimmung der molekularen Details der Protein- Kohlenhydrat Wechselwirkung. Die Ergebnisse aus dem Projekt sollten allgemein zu einem besseren Verständnis der Wechselwirkung von bakteriellen Zelloberflächenkohlenhydraten mit Lektinen führen und somit die Basis zur Entwicklung von neuen anti-inflammatorischen Wirkstoffen für einen potentiellen Einsatz in der Therapie von Entzündungen und Allergien liefern.

Die Ergebnisse aus dem Projekt haben zu neuen Methoden der chemischen Synthese von bakteriellen Zelloberflächen-Kohlenhydraten geführt und damit die Basis zur Entwicklung von potentiellen Impfstoffen und Diagnostika bei klinisch relevanten Infektionen erweitert. Dieses Thema ist vor allem vor dem Hintergrund der zunehmenden Antibiotikaresistenz und dem vermehrten Vorkommen von multiresistenten Keimen von großer globaler medizinischer und gesundheitspolitischer Relevanz. Infektionen durch Acinetobacter-Stämme sind durch deren ausgeprägte Antibiotikaresistenz besonders schwierig zu behandeln und hatten bereits die Schließung von Intensivstationen zur Folge. Die Zielstrukturen des Projekts sind in der äußeren Membran der Zellwand Gram-negativer Bakterien lokalisiert und umfassen Lipid-gebundene Kohlenhydrate (Lipopolysaccharide), die vielfältige Interaktionen mit dem angeborenen und erworbenen Immunsystem eingehen. Im Projekt wurde speziell ein strukturell konservierter Abschnitt des Lipopolysaccharids von Acinetobacter bearbeitet, der längerkettige Zucker mit sieben sowie acht Kohlenstoffatomen enthält. Eine Besonderheit der Acinetobacter-Zellwandstrukturen liegt einerseits in ungewöhnlichen Verknüpfungen der weit verbreiteten bakteriellen C-8 Zuckersäure Kdo (3-Desoxy-octulosonsäure) und in der Präsenz einer besonders säurestabilen Kdo-Variante (Ko). Im Projekt gelang es erstmals, diese Acinetobacter-typischen Strukturen durch chemische Synthese herzustellen, wobei wesentliche Verbesserungen in den Syntheseausbeuten und in der Selektivität der Zuckerverknüpfungen erzielt werden konnten. Insgesamt wurde eine Substanzbibliothek mit 20 Oligosacchariden hergestellt. In der Folge wurde die Bindung der Syntheseprodukte und der aus den Bakterien isolierten Zellwandfragmente an Antikörper und Lektine in Kooperation mit Gruppen aus dem Forschungszentrum Borstel (Deutschland) und der University of Victoria (Kanada) im Detail untersucht. In Bindungsexperimenten an Mannose-bindende Lektine (MBL-A, MBL-C) zeigten einzelne Syntheseprodukte zwar eine höhere Affinität als Mannose, aber noch nicht die sehr ausgeprägte Reaktivität der bakteriellen Zellwandfragmente. Die Bindungsdaten lassen jedoch vermuten, dass vor allem die der Membran näher gelegenen Abschnitte für die hohe Affinität ausschlaggebend sind.Neue Erkenntnisse wurden auch durch Röntgenstrukturdaten von modifizierten Kdo-Liganden in der Bindung an Kdo-spezifische Antikörper gewonnen, die die Hypothese der Selektion der Antigene durch präformierte Antikörper untermauern und die Wirksamkeit der angeborenen Immunantwort verstärken, da die Erkennung dieser bakteriellen Zucker genetisch bereits in der Keimbahn angelegt ist. Die neuen Syntheseverfahren können nunmehr für die Entwicklung Acinetobacter-spezifischer Antikörper eingesetzt werden.