Die Rolle des Orai N-Terminus und des 2. Loops in der Kopplung mit STIM1

Der Kalziumtransport in die Zelle erfolgt hauptsächlich über speicheraktivierte Ionenkanäle, wobei der sogenannte Ca2+ release-activated Ca2+ (CRAC) Kanal den Prototyp darstellt. Zu seinen Schlüsselkomponenten zählen der luminale Kalzium-Sensor STIM1 und der Ionenkanal Orai, welche nach der Speicherentleerung über ihre Carboxytermini aneinander koppeln und somit den Kalzium-Einstrom in die Zelle aktivieren. In diesem Projekt wollen wir Schaltdomänen finden und deren Wechselwirkung charakterisieren. Aminosäuren, die im Orai-N-terminus wie auch -loop2 für die Aktivierung durch STIM1 notwendig sind sollen identifiziert werden. Hier wird der Fokus zuerst auf die Rolle der konservierten Region im N-terminus gelegt, welcher neben dem C- terminus, wichtig in der Interaktion mit und im Schalten durch STIM1, ist. (i) Essentielle Aminosäuren werden mittels N-terminalen Punkt- bzw Deletionsmutanten ermittelt. Eine Reduktion oder ein Fehlen des Ca2+ Einstroms über diese Mutanten könnte auf eine gehinderte STIM1 Interaktion oder einen Gating-Defekt hinweisen. (ii) Eine mögliche Beeinträchtigung der Interaktion von STIM1 mit den N-terminal mutierten Orai1 Proteinen wird mit Hilfe eines neuen Ansatzes, welcher auf konstitutiv aktiven Orai1 V102A/C Mutanten basiert, analysiert. Die Ca2+- Selektivität dieser Mutanten kann in der Gegenwart von STIM1 wiederhergestellt werden. Somit stellen die Mutanten einen wichtigen Ausleseparameter für die STIM1 Interaktion an mutierten Orai-Proteinen dar. (iii) Zur Unterscheidung zwischen einer Beeinträchtigung des Schaltens und einer blockierten STIM1 Kopplung, wird versucht N-terminale Deletions- oder Punktmutanten durch den Austausch von loop2 oder C-terminus durch jenen von Orai3 wieder zu aktivieren. Dieser Ansatz mittels Chimären beruht auf unseren Resultaten, dass Orai3 zur speicherabhängigen Aktivierung weniger von der konservierten Domäne im N-terminus benötigt als Orai1. (iv) In einem komplementären Ansatz werden wir mittels eines neuen FRET-basierenden Assays (FIRE) die Interaktion von individuellen cytosolischen STIM1- und Orai1-Fragmenten analysieren. Hiermit sollen für die Kopplung wichtige Aminosäuren bzw sequenzen nachgewiesen und die funktionellen Resultate bestätigen werden. Zusammenfassend, bietet die Identifikation von Interaktionsdomänen einen grundlegenden Einblick in den Schaltmechanismus von STIM1/Orai Kanälen und stellt eine Basis für die spezifische pharmakologische Beeinflussung von speicherabhängigen Kanälen dar.

Der Kalziumtransport in die Zelle erfolgt hauptsächlich über speicheraktivierte Ionenkanäle, wobei der sogenannte Ca2+ release-activated Ca2+ (CRAC) Kanal den Prototyp darstellt. Zu seinen Schlüsselkomponenten zählen der luminale Kalzium-Sensor STIM1 und der Ionenkanal Orai, welche nach der Speicherentleerung über ihre Carboxytermini aneinander koppeln und somit den Kalzium-Einstrom in die Zelle aktivieren. In diesem Projekt untersuchten wir gezielt Schaltdomänen sowohl in STIM1 wie auch Orai und deren potentielle Kopplung. Aminosäuren, die im Orai-N-terminus wie auch -loop2 für die Aktivierung durch STIM1 notwendig sind sollten identifiziert werden. Hier wurde der Fokus zuerst auf die Rolle der konservierten Region im N-terminus gelegt, welcher neben dem C- terminus, wichtig in der Interaktion mit und im Schalten durch STIM1, ist. Als wichtige Resultate zum Verständnis der STIM1/Orai Kopplung kann (i) das Auffinden vonhot-spot Aminosären innerhalb des konservierten Bereichs des Orai N-terminus, die essentiell für die Aktivierung und das Gating des Orai Kanals sind, (ii) die molekulare Auflösung der ersten 3D Struktur von interagierenden STIM1/Orai C-termini, und das Verständnis um die Kontrolle des Aktivitätszustandes von STIM1 durch (iii) einen coiled-coil clamp Mechanismus sowie (iv) durch eine Krankheits-relevante C-terminale Mutation, gesehen werden. Durch die Einführung zweier neuer Methoden zur funktionellen Charakterisierung von STIM-Orai Wechselwirkungen oder von deren Fragmenten wurde zusätzlich ein wertvoller Betrag zum allgemeinen Technik-Repertoire geleistet. Zusammenfassend wurde durch die Identifikation von Interaktionsdomänen ein grundlegender Einblick in die Schaltmechanismen des STIM1/Orai Systems erhalten, die eine essentielle Basis für die spezifische pharmakologische Beeinflussung von speicherabhängigen Kanälen zur Behandlung für z.B. immunologischen Erkrankungen darstellt.