Retinylester-Hydrolase(n) von hepatischen Stellatzellen

Vitamin A (Retinol und seine Metabolite) stellt in Säugetieren ein essenzielles, fett-lösliches Spurenelement dar. Seine biologische Wirkung übt es über zwei Hauptmetabolite, dem 11- cis-Retinaldehyd und der all-trans-/9-cis- Retinsäuren, aus. Retinaldehyd ist der hn Akzeptor des Seezykluses; Retinsäuren sind Liganden für spezifische, nukleäre Rezeptoren, die die Genexpression regulieren und dadurch für Wachstum, Entwicklung und die Aufrechterhaltung des Lebens unerlässlich sind. Säuger nehmen Vitamin A über die Nahrung auf und speichern dieses in großer Menge als Retinylester (RE) in spezialisierten Leberzellen, den hepatischen Stellatzellen (HSZ). Die Mobilisierung dieser RE-Speicher wird durch Lipasen bewerkstelligt, die RE hydrolisieren und damit Retinol freisetzen, welches in die Zirkulation sekretiert wird. Allerdings ist bis dato kein Enzym bekannt, welches für die Mobilisierung dieser Speicher verantwortlich ist. HSZ RE-Speicher sind auch in einem pathologischen Prozess, dem Beginn der Leberfibrose, wichtig. Nach einer Leberschädigung werden HSZ aktiviert und transformieren zu myofibroblasten-ähnliche Zellen, welche sodann viele extrazelluläre Matrixproteine bilden und interessanterweise ihre RE-Speicher vollständig verlieren. Bis jetzt ist unbekannt, warum in der Frühphase der Fibrose die HSZ ihre RE-Speicher entleeren und welche Proteine dabei involviert sind. Das Ziel dieser Studie ist die Identifizierung von RE-Hydrolase(n) in HSZ. Da RE in Lipidtropfen von HSZ gespeichert werden, gehen wir einen direkten Lösungsweg. Zunächst werden wir Lipidtropfen von der Stellatzell- Linie HSC-T6 isolieren. In Folge werden wir das Lipidtropfen-Proteom mittels Massenspektrometrie bestimmen, bioinformatisch analysieren und auf potentielle RE-Hydrolasen untersuchen. Diese Vorgehensweise erlaubt uns, den gesamten Vorgang von der Isolierung bis zur Analyse mit relativ leicht zugänglichen Proben zu verfeinern. Danach werden wir von primären HSZ der Mausleber Lipidtropfen isolieren und das Proteom bestimmen. Weiters, da aktivierte HSZ möglicherweise RE-Hydrolasen überexprimieren, werden wir HSZ von Mäusen isolieren, die zuvor mit Kohlenstofftetrachlorid behandelt wurden, um die HSZ zu aktiviert. Alternativ dazu werden wir HSZ in vitro durch Kultivierung aktivieren. Sodann werden wir von aktivierten HSZ Lipidtropfen isolieren, das Proteom bestimmen und bioinformatisch analysieren. Alle identifizierten RE-Hydrolasen werden wir Klonieren und biochemisch in in vitro und Zellexperimenten charakterisieren. Wir erwarten uns, dass RE-Hydrolasen in der Lage sind, Lipidtropfen-assozierte RE zu spalten und in lebenden Zellen RE zu mobilisieren. Insgesamt sollen in dieser Arbeit Enzyme, die die Mobilisierung der RE-Speichern von HSZ bewerkstelligen, identifiziert werden.

Säugetiere speichern große Mengen an Vitamin A in spezialisierten Zellen der Leber, in den sog. hepatischen Stellatzellen. Diese Vitamin A-Speicher bestehen aus Retinylestern, welche in zytosolischen Lipidtropfen vorliegen. Bislang ist unbekannt, welche Enzyme (sog. Retinylester-Hydrolasen) für die Mobilisierung dieser Vitamin A-Speichern verantwortlich sind. Das Ziel dieses Projekts war es, Retinylester-Hydrolasen von hepatischen Stellatzellen zu identifizieren. Dazu wurde ein direkter Lösungsweg und zwar die proteomische Analyse von Lipidtropfen-Proteinen von hepatischen Stellatzellen gewählt. Bei der Untersuchung von Lipidtropfen-Proteinen wurde als Lipidtropfen-Protein die bekannte Triglyzerid-Hydrolase des Fettgewebes, die Adipozyten-Triglyzerid-Lipase (ATGL), identifiziert. Im Rahmen dieses Projektes konnten wir zeigen, dass ATGL in primären, hepatischen Stellatzellen exprimiert ist und auch Retinylester spaltet. Primäre hepatische Stellatzellen von Mäusen, denen das Enzym ATGL fehlt (von sog. ATGL-ko Mäusen), weisen einen erhöhten Retinylester-Gehalt auf. Weiters wurden die Retinylester-Speicher hepatischer Stellatzellen von ATGL-ko Mäusen nur verzögert mobilisiert. Interessanterweise wiesen ATGL-ko Mäuse jedoch keinen erhöhten Retinylester-Gehalt in der Leber auf. Zusammen deuten diese Beobachtungen darauf hin, dass ATGL bei der Mobilisierung von Retinylestern von hepatischen Stellatzellen involviert ist, jedoch nicht alleinig dafür verantwortlich ist. Im Rahmen dieses Projektes konnte als weitere Retinylester-Hydrolase die Lysosomale-Saure-Lipase identifiziert werden. Dieses Enzym ist bekanntlich in den Lysosomen für die Hydrolyse von Neutrallipiden, vor allem von Cholesterinestern verantwortlich. Unsere Untersuchungen ergaben, dass die Lysosomale-Saure-Lipase essentiell für die Hydrolyse von Retinylestern im Lysosom ist. Mäusen, denen dieses Enzym fehlt, wiesen eine Akkumulation von Retinylestern u.a. im Darm auf. Weiters war in diesen Tieren auch die Verfügbarkeit von Vitamin A aus der Nahrung vermindert. Diese Untersuchungen ergaben, dass die Lysosomale-Saure-Lipase physiologisch eine wichtige Rolle als Retinylester-Hydrolase spielt. Zum Projektende wurde eine weitere proteomische Untersuchung von Lipidtropfen-Proteinen der humanen hepatischen Stellatzell-Linie LX2 begonnen. Auch im Lipidtropfen-Proteom von humanen Stellatzellen wurde das Enzym ATGL identifiziert. Es ist davon auszugehen, dass auch die humane ATGL Retinylester hydrolysieren vermag und eine Rolle bei der Mobilisierung von Vitamin A spielt. Im Rahmen dieses Projektes wurde zudem eine Reihe von Kooperationen mit nationalen und internationalen Forschungsgruppen auf dem Gebiet des Lipidstoffwechsels durchgeführt. In Summe konnten 13 wissenschaftliche Arbeiten, ein Methodenartikel und zwei Review-Artikel veröffentlich werden.