Strukturelle Charakterisierung von Typ 3-Kupferproteinen

Polyphenoloxidasen sind allgegenwärtig in vielen Organismen, wie Bakterien, Pilzen Pflanzen und auch Menschen vorhanden. Die Funktion dieser Proteine (Tyrosinase, Catecholoxidase und Aureusidinsynthase) besteht in der Oxidation von phenolischen Substraten. Die Enzyme beinhalten ein Typ III Kupferzentrum. Polyphenoloxidasen werden in vivo in ihrer latenten Form hergestellt und weiter in eine aktive Form prozessiert. Tyrosinase katalysiert zwei Reaktionen (Hydroxilierung und Oxidation) im Rahmen der Bildung von braunen Pigmenten (z.B. Melanine). Aureusidinsynthase katalysiert eine Hydroxilierung und Oxidation von o- diphenolischen Chalkonen zu den zugehörigen Auronen. Diese Aurone sind verantwortlich für die gelbe Blütenfärbung in Asteraceae. Das Projekt soll einen fundamentalen Beitrag zum molekularen Verständnis der Funktion der Polyphenoloxidasen leisten. Die Ziele des Antrages sind die Kristallstrukturen von mehreren unterschiedlichen Polyphenoloxidasen- Isoformen (hier Tyrosinase aus Champignons und Aureusidinsynthase aus Mädchenauge) in ihren latenten und ihren proteolytisch aktivierten Formen zu untersuchen. Zur Untersuchung der Struktur und des Aktivierungsprozesses von Polyphenoloxidasen wird eine Kombination von Proteinisolierung, biochemischer Charakterisierung, molekularbiologischen Methoden und der Röntgenstrukturanalyse eingesetzt. Rekombinant hergestellte Tyrosinase und Aureusidinsynthase soll hohe Konzentrationen an reinem Protein liefern. Gegenwärtig sind fünf Gensequenzen (PPO 1 - 5) der Tyrosinase aus Champignons bekannt. Nur die aktive Form (bestehend aus den Aminosäureresten 2-392 von insgesamt 576) von PPO3 ist derzeit kristallographisch bekannt. Demzufolge gibt es keine ausreichende Charakterisierung von PPO 1, 2, 4 und 5 in der aktiven Form und von allen latenten Formen der PPO 1 bis 5. Die Sequenzanalyse der fünf PPOs aus Champignons zeigt große Unterschiede was Sequenzlänge und Glykolysierung betrifft. Insbesondere zeigt PPO4 ein um 35 Aminosäuren längeres C-Ende. Diese 35 Aminosäuren sind sehr hydrophob. PPO4 gilt unser größtes Interesse. Eine röntgenographische Charakterisierung der Ausreusidinsynthase liegt bis heute nicht vor. Neben dem Aktivierungsprozess sollen Aureusdinsynthasekristalle mit unterschiedlichen Substraten co-kristallisiert werden, um die hohe Substratspezifität des Enzyms zu studieren und zu verstehen, wie Selektivität in enzymatischen Reaktionen realisiert wird. Zudem erwarten wir über dieses Projekt Reaktionsmechanismen für Polyphenoloxidasen favorisieren oder ausschließen zu können.

Polyphenoloxidasen (PPOs) sind eine Gruppe von Typ 3-Kupfer Metalloenzymen zu denen Tyosinasen (Tyrs), Catecholoxidasen (COs) und Auronsynthase (AUS) gehören. Tyrs katalysieren die ortho-Hydroxylierung von Monophenolen (Monophenolase Aktivität) und die da- rauffolgende Oxidation der entstehenden ortho-Diphenole zu ortho-Chinone (Diphenolase Aktivität), wohingegen COs nur die letztere Reaktion katalysieren können. Die ortho-Chinone sind hochreaktiv Ausgangsverbindungen für die Biosynthese von Melanin. AUS katalysiert die Synthese von Auronen ausgehend von Chalkonen und ist somit an der Gelbfärbung von einigen Zierpflanzen beteiligt. Unsere Forschungsziele waren die Produktion der Pilztyrosi- nase aus Agaricus bisporus (abPPO4) und der Auronsynthase aus Coreopsis grandiflora (cgAUS1) in möglichst hoher Ausbeute und deren biochemische und strukturelle Charakterisierung, um Erkenntnisse über den katalytischen Mechanismus von PPOs zu erhalten. Wir haben effiziente Extraktions- und Reinigungsprotokolle für die Isolierung beider Enzyme aus ihrer jeweiligen natürlichen Quellen entwickelt. Später haben wir Protokolle für die hocheffiziente Expression und Aufreinigung der Enzyme in rekombinanter Form erstellt, die ausreichende Mengen an Enzym für weitere Charakterisierungen lieferten. Beide Enzyme wurden sowohl in ihrer latenten als auch aktiven Form biochemisch charakterisiert und die Ergebnisse lieferten die exakte Schnittstelle an der Domäne, die das aktive Zentrum abdeckt. Die kinetische Charakterisierung der Substratspezifität von cgAUS ergab, dass sich cgAUS in mehrerer Hinsicht von anderen Enzymklassen unterscheidet und deswegen wurde cgAUS letztendlich als Auronsynthase klassifiziert, was diese zu einer neuen, speziellen Untergruppe der PPOs macht. Interessanterweise, war cgAUS, von der man glaubte sie besäße ähnlich wie COs keine Hydroxylase-Aktivität, da sie keine typischen Substrate der Tyrosinase (z.B. Tyrosin) umsetzen kann, aktiv auf das natürliche Monphenol-Substrat Isoliquiritigenin. Kristallisationsexperimente lieferten die Kristallstruktur einer latenten pflanzlichen PPO (cgAUS1) und führten zur ersten Veröffentlichung eines heterogenen Kristalls, der die aktive als auch latente Form einer Pilztyrosinase (abPPO4) in einer einzigen Kristallstruktur enthält. Die Analyse ergab, dass alle strukturell bekannten PPOs sehr ähnliche aktive Zentren besitzen, weshalb es schwierig ist, strukturelle Merkmale für die Substratspezifizität zu bestimmen. Jedoch zeigten Molecular Dynamics Studien mit verschiedenen Substraten an cgAUS, dass Aminosäuren, die am Eingang zum aktiven Zentrum liegen, eine entscheidende Rolle bei der Substratspezifizität spielen, da sie abhängig von der Struktur des Substrats dessen Position innerhalb des aktiven Zentrums entweder stabilisieren oder destabilisieren. Wir haben einen neuen Mechanismus für die katalytische Reaktion von PPOs vorgeschlagen, der sich auf diese Substrat-stabilisierenden/destabilisierenden Reste konzentriert.