Genkorrektur mittels "double RNA trans-splicing"

Für eine gezielte Genkorrektur auf mRNA Ebene kann die Methode des Spliceosome Mediated RNA Trans- splicing herangezogen werden. 3 verschiedene RNA Trans-Splicing Varianten (5`, 3` und double RNA Trans- Splicing) stehen zur Verfügung und wurden für diverse genetische Krankheiten bereits evaluiert. Hierbei sind unter anderen die Krankheiten Epidermolysis bullosa, Hämophilie und cystische Fibrose zu nennen. Über RNA Trans- Splicing wird die endogene Splicing Maschinerie verwendet, um 2 Pre-mRNA Moleküle zu einem neuen Genprodukt zu reprogrammieren. Ein konstruiertes RNA Trans-Splicing Moleküle (RTM) induziert den Trans- Splicing Vorgang über die Bindung am Target Pre-mRNA Molekül. Dabei wird die mutierte Genregion durch die Wildtyp Genregion am RTM ersetzt. Die Kombination aus 5` und 3` Trans-Splicing wird als double RNA Trans- Splicing oder Internal Exon Replacement (IER) bezeichnet und wird für den Austausch von zentralen Genregionen verwendet. Dies ist eine elegante Anwendung, die jedoch durch ihre geringe Effizienz selten für Studien herangezogen wurde. Aktuelle Daten aus unserem Labor (Koller et al. 2011), zeigen die Funktionalität dieser Methode über ein GFP basierendes Screening System. Das Ziel dieser vorliegenden Arbeit ist es, Faktoren ausfindig zu machen, die die Effizienz der Methode weiter verbessern. Primär wollen wir die Bindeeigenschaften von konstruierten RTMs am Target Molekül verbessern, bzw. über die Blockade von kompetitiven Splice Sites am Target Molekül über Antisense Oligonukleotide die Trans-Splicing Effizienz erhöhen. Zum ersten Mal soll die Methode für die Korrektur von EB relevanten COL7A1 Mutationen ihre Anwendung finden. Zusätzlich können durch die Anwendung dieser Methode verschiedene Hürden (endogene Überexpression, Größenlimitierung des Transgens, Vorliegen von Isoformen des Zielgens), die in konventionellen Applikationen vorliegen, vermieden oder reduziert werden. Die Entwicklung einer Gentherapie für Typ VII defizienten Patienten würde die Heilungsaussicht für die Krankheit der dystrophen Epidermolysis bullosa erhöhen. Außerdem würde die Verbesserung der Methode uns einen Schritt näher in Richtung Behandlung verschiedener genetischer Krankheiten bringen deren Ursache Mutationen in großen Genen sind. Daher ist das COL7A1 Gen, mit einer Größe von über 9kb, für diese Methode besonders geeignet. Das RTM trägt nur wenige Exons und kann daher sehr kurz gehalten werden, was die Einbringung ins Host Genom wesentlich erleichtert. Über das im Labor entwickelte Screening System sollte es möglich sein die Trans-Splicing Effizienz von konstruierten RTMs entscheidend zu erhöhen, um eine phänotypische Veränderung von EB Patientenzellen in Richtung Wildtyp herbeizuführen.

Im Projekt Genkorrektur mittels double RNA trans-splicing wurde die Technologie des double RNA trans-splicings verwendet um gezielt genetische Veränderungen (= Mutationen) im Kollagen 7 Gen (bzw. der aus dem Gen resultierenden RNA) zu korrigieren. Bei der dystrophen Form der erblichen blasenbildenden Hauterkrankung Epidermolysis bullosa (DEB) führen Mutationen im Kollagen 7 Gen zum völligen Verlust von Kollagen VII Protein in der Haut. Die sehr seltene Erkrankung ist mit erheblichen Schmerzen verbunden, bedarf der 24/7 Pflege und ist derzeit unheilbar. Die Haut der betroffenen Patienten, die in Österreich wegen ihrer extrem empfindlichen Haut als Schmetterlingskinder bekannt sind, löst sich bereits bei geringster Beanspruchung ab. Dadurch entstehen z. T. großflächige Wunden, von denen einige über Monate und Jahre nicht verheilen und Ursache für die Entstehung besonders aggressiver Hauttumore sind. Im Zuge des Projekts entwickelten wir ein Reparaturmolekül, genannt dRTM, das dazu benutzt werden kann eine kleine interne Genregion, auf der sich die Mutation befindet, gegen eine gesunde Abschrift der Genregion auszutauschen. Hierzu verwendeten wir ein in unserem Labor etabliertes auf Fluoreszenz basierendes Modellsystem, welches uns erlaubt die Funktionalität eines dRTMs Schritt für Schritt in Testzellen zu überprüfen. Wir haben zwei verschiedene dRTM Moleküle für zwei definierte Kollagen 7 Genregionen hergestellt. Beide Moleküle zeigten im Modellsystem einen erfolgreichen Austausch der jeweiligen mutierten internen Kollagen 7 Genregion durch eine gesunde Abschrift. Die beiden dRTMs wurden daher für die Anwendung an kultivierten Patientenzellen entsprechend adaptiert. Über einen Retrovirus wurden die dRTMs in die Patientenzellen eingebracht und dabei in die Erbsubstanz integriert um eine dauerhafte Produktion der Moleküle zu gewährleisten. Im Anschluss an die Behandlung der Patientenzellen konnten wir dann über molekularbiologische Studien zeigen, dass die Reparatur von den dRTMs im Kollagen 7 Gen wie erwartet durchgeführt, und als Folge davon die Bildung des Kollagen VII Proteins partiell wiederhergestellt wurde. Da die generelle Reparatureffizienz der Moleküle in den Patientenzellen sehr gering ausfiel haben wir sogenannte Antisense RNAs (asRNAs) entwickelt, die gezielt an der Zielregion im Gen binden um folglich die Reparatureffizienz der dRTMs zu erhöhen. Wir konnten für beide Kollagen 7 Genregionen asRNAs entwickeln, die in unserem Modellsystem eine signifikante Erhöhung der Reparatureffizienz bewerkstelligten. Folglich können wir folgendes Resümee ziehen. Im Zuge des Projekts konnten wir zum ersten Mal zeigen dass der Austausch interner Genregionen über die Methode des double RNA trans-splicings möglich ist. Die geringe Reparatureffizienz der Methode in Patientenzellen kann durch die Zugabe von sogenannten asRNAs entscheidend erhöht werden. Dies muss aber nun noch in weiteren Studien in Patientenzellen bestätigt werden. In unserer Studie wurde eine Methode weiterentwickelt mit deren Hilfe man Mutationen insbesondere in sehr großen Genen, für die alternative Therapieansätze (z.B. der Austausch des gesamten Gens) nicht in Frage kommen korrigieren kann.