Gerichtete Evolution einer ß-Galaktosidase in einer ß-Transgalaktosidase

Die klassische chemische Synthese von Oligosacchariden ist wegen der hohen Anzahl an regio- und stereochemischen Verknüpfungen äußerst arbeits- und zeitintensiv. Eine enzymatische Synthese bietet sich daher als Alternative an. Glykosidasen hydrolysieren glycosidische Bindungen über einen double-displacement Mechanismus, bei dem der abgespaltene Zucker kovalent an das Enzym gebunden ist und dieser Komplex dann hydrolysiert wird. Unter bestimmten kinetischen Bedingungen können diese Enzyme aber auch für die Synthese von glycosidischen Bindungen aufgrund ihrer Transglykosylierungsaktivität verwendet werden. Hierbei wird der ans Enzym gebundene Zucker auf ein Akzeptorsacharid anstelle eines Wassermoleküls übertragen. Trotz einer Vielzahl an Anwendungen ist die Verwendbarkeit von Glykosidasen für die Kohlehydratsynthese eingeschränkt durch die Schwierigkeit geeignete Reaktionsbedingungen zu finden, die die Reaktion in Richtung Transglykosylierung treiben, ohne die Hydrolyse des Reaktionsprodukt zuzulassen. Eine Möglichkeit, diese Schwierigkeiten zu umgehen, ist das Enzym gentechnisch zu verändern. Eine gerichtete Evolution von Glykosidasen wird neue, wichtige Aminosäurepositionen in und um das aktive Zentrum herum, sowie weiter entfernte Positionen, die mit dem Transglykosylierung / Hydrolyse Verhältnis im Zusammenhang stehen, hervorbringen. Das Ziel ist die Erzeugung einer echten Transglykosidase ohne hydrolytische Aktivität. Ziel dieses Projekts ist es, eine Kombination aus semi-rationalem Proteindesign und gerichteter Evolution zu verwenden, um eine ß-Galaktosidase in eine ß-Transgalaktosidase umzuwandeln, und ein mutiertes Enzym zu generieren, das in der Lage ist Galaktose auf N-Acetylglukosamin zu übertragen. Das Produkt dieser Reaktion, Lakto-N-biose, ist ein Baustein humaner Milcholigosacharide. Das Enzym, mit dem in dem vorgestellten Projekt gearbeitet wird, ist die ß-Galaktosidase aus Lactobacillus reuteri, der Glykosidhydrolasefamilie 2 zugehörig, dessen Kristallstruktur zurzeit entschlüsselt wird. Ein Screening für erhöhte Transferaktivität von Glykosidasen ist sehr schwierig, da es keine offensichtlichen Veränderungen in Fluoreszenz oder Absorption gibt, die mit der Ausbildung einer glykosidischen Bindung in Verbindung stehen. Deshalb wird ein modifiziertes Hochdurchsatzscreening verwendet werden, das von der Gruppe von Stephen Withers für Glykosyltransferasen entwickelt worden ist. Dort werden E. coli Zellen in einem Durchflusszytometer (FACS) nach ihrer Fluoreszenz sortiert, die von in den Zellen eingeschlossenen, fluoreszierenden Transglykosylierungsprodukten stammt. Die interessantesten Enzymvarianten werden einer detailierten Charakterisierung unterzogen werden, die auch die Identifikation der Tansglykosylierungsprodukte mittels HPLC und NMR beinhaltet. Die Kristallstrukturen der besten Varianten werden von unserem Kooperationspartner ermittelt werden. Wir erwarten uns neue Einsichten in die Wechselwirkungen von Proteinstruktur und funktion von ß-Galaktosidasen, vor allem was die Balance zwischen Hydrolyse und Transglykosylierung betrifft. Diese Erkenntnisse werden auch von Vorteil sein, um andere Glykosidasen in Transglykosidasen umwandeln zu können. Die aus dieser Arbeit resultierenden Enzymvarianten könnten Teil eines Baukastens für die Synthese von maßgeschneiderten Oligosachariden sein.

ß-Galaktosidasen katalysieren sowohl die Hydrolyse, als auch die Übertragung von Zuckerbausteinen auf andere Zucker wie Laktose oder Zellobiose (Transglykosylierung). Diese Eigenschaften machen diese Enzyme interessant für biotechnologische Anwendungen, wie die Produktion von Galakto-oligosacchariden (GOS) aus Laktose. Als sogenannte Präbiotika, unverdauliche Lebensmittelbestandteile, haben GOS einen positiven Einfluss auf die intestinale Mikroflora. GOS sind wesentliche Bestandteile der menschlichen Muttermilch, als solche sind sie von großem Interesse für Säuglingsmilchprodukte, welche zu den am häufigsten industriell produzierten Präbiotika gehören.Wir untersuchten das Transgalaktosylierungspotential von ß-Galaktosidasen aus Streptococcus thermophilus und aus Bifidobacterium breve. Es wurde gezeigt, dass alle drei aufgrund ihrer hohen Transgalaktosylierungsaktivität für die Herstellung von GOS geeignet sind. Es wurde eine GOS-Ausbeute von bis zu 50 % der Gesamtzucker erzielt.Anhand von Varianten der Halothermotrix orenii ß-Glukosidase wurde der Mechanismus der Transglykosylierungsaktivität genauer untersucht. Dafür wurde mit gentechnischen Methoden die Aminosäuresequenz des Enzyms an je einer Position verändert. Zuerst wurden fünf Positionen (N222F, N294T, F417S, F417Y und Y296F) verändert. Von allen Varianten zeigten F417S und F417Y die besten GOS-Ausbeuten, welche verglichen mit dem Wildtyp (WT) um ein Drittel erhöht waren. Anschließend wurde der Einfluss von Veränderungen der Position F417 im Detail untersucht. Die Aminosäure an dieser Position wurde durch alle anderen möglichen Aminosäuren ersetzt und die dadurch ausgelösten Veränderungen in der Aktivität wurde untersucht. Eine dieser Varianten, F417T, zeigte eine 3-fach höhere Präferenz für Laktose als für Zellobiose, wohingegen der WT eine 15-fach höhere Selektivität für Zellobiose gegenüber Laktose zeigte ? aus einer ?-Glukosidase wurde eine ?-Galaktosidase. Durch andere Variationen konnte das Spektrum der produzierten GOS verändert werden. Zusammenfassend konnte durch den Austausch einer einzigen Aminosäure die Aktivität stark verändert werden. Diese Erkenntnisse können zur Herstellung von maßgeschneiderten Enzymen für die Produktion von Präbiotika mit einer optimalen Zusammensetzung führen..