Mechanismus der Nukleotide-vermittelten Inhibierung mitochondrialer Entkopplerproteine

Eine genaue Regulation des Protonentransports in Mitochondrien ist essentiell für physiologische Prozesse wie ATP-Synthese, Wärmeproduktion durch mitochondriales Entkopplerprotein 1 (UCP1) und wahrscheinlich auch für die Regulation der Produktion von Sauerstoffradikalen (ROS) durch das Entkopplerprotein 2 (UCP2). Die in die Regulation des Protonentransports involvierten Proteine gewinnen daher zunehmend als Targets für Pharmaka in der Therapie von Adipositas sowie verschiedener entzündlicher, neurodegenerativer und ischämischer Krankheiten an Bedeutung. Wir und andere Forschergruppen haben bereits gezeigt, dass der UCP1/UCP2-vermittelte Protonentransport durch Purinnukleotide (PN) gehemmt wird. Allerdings sind die molekularen Grundlagen der Inhibierung noch nicht verstanden. Es ist darüber hinaus ein Rätsel, wie UCP in vivo funktioniert, obwohl ATP in sehr hohen (millimolaren) Konzentrationen in den Mitochondrien vorhanden ist. Ziel dieses Projekts ist eine quantitative Charakterisierung der Bindung zwischen UCP und PN mit zwei verschiedenen Verfahren: (i) mit elektrophysiologischen Messungen der Membranleitfähigkeit und (ii) mit der hochauflösenden Rasterkraftmikroskopie ("atomic force microscopy", AFM). Zwei Modi des AFM, "topographical" und "recognition" (TREC), kommen dabei zum Einsatz. Die Funktionalisierung des Cantilievers mit PN ermöglicht die Identifizierung von Protein-Nukleotid-Bindungen bei gleichzeitiger Visualisierung des Zielproteins. Die Daten werden mit elektrophysiologischen Messungen verglichen, die sowohl die Bindung als auch die Inhibierung des Proteins in der Anwesenheit von PNs registrieren. Das gut etablierte Modell der Lipiddoppelschicht wird zum ersten Mal für detaillierte Studien der Kinetik von PN Bindung und Inhibierung in Abhängigkeit von pH, Osmolarität und Transmembranpotential eingesetzt. Verschiedene Purinnukleotide (Tri-, Di-, Monophosphate) werden vergleichend untersucht. Die kritische Analyse der Resultate beider Methoden wird vor dem Hintergrund der kürzlich veröffentlichten NMR-Struktur des UCP2-Proteins neue Erkenntnisse über die Struktur der Entkopplerproteine sowie den Mechanismus der Protein-Nukleotid-Bindung vermitteln. Letzteres schafft Voraussetzungen für neue pharmakologische Ansätze im Kampf gegen die oben erwähnten Krankheiten.

Eine genaue Regulierung des Protonentransports in Mitochondrien ist essentiell für physiologische Prozesse wie ATP-Synthese, Wärmeproduktion, sowie für die Regulation der Produktion von Sauerstoffradikalen (ROS). Die involvierten Entkoppler-Proteine (UCP) gewinnen daher zunehmend an Bedeutung als Ziele für Pharmaka in der Therapie der Fettleibigkeit sowie verschiedener entzündlicher, neurodegenerativer und ischämischer Krankheiten. Im Rahmen dieses Projekts haben wir die Bindung zwischen UCP1/UCP3 und Purinnukleotiden (PN), die die Aktivität von UCPs reduzieren, mit zwei verschiedenen Verfahrencharakterisiert:(i)mit elektrophysiologischenMessungen der Membranleitfähigkeit und (ii) mit der hochauflösenden Rasterkraftmikroskopie (AFM). Die zwei AFM-Verfahren, Erkennung und Kraftmessung, ermöglichten die Quantifizierung von Protein-Nukleotid-Bindungskräften bei gleichzeitiger Visualisierung des Zielproteins. Diese Daten haben wir mit den Ergebnissen der elektrophysiologischen Messungen verglichen, die sowohl die Bindung als auch die Inhibierung des Proteins in der Anwesenheit von PNs charakterisieren. Für die Messungen der Kinetik von PN Bindung haben wir zum ersten Mal das gut etablierte Modell der Lipiddoppelschicht eingesetzt. Verschiedene PN (Tri-, Di- und Monophosphate) wurden vergleichend untersucht. Wir zeigten, dass UCP3 ähnlich wie UCP1 stärker durch ATP als ADP inhibiert ist. AMP ist ein relevanter Inhibitor für beide Proteine. Im Unterschied zu UCP1 konnte UCP3 durch alle PN vollständig inhibiert werden, und die IC50 stieg mit abnehmender PN-Phosphorylierung. UCP1 konnte nur von ATP vollständig inhibiert werden, während deren maximale Inhibierung von der PN- Phosphorylierung abhing. Gezielte Protein-Mutationen ergaben, dass die in allen UCPs konservierten Arginine in unterschiedlichem Ausmaß an der Inhibierung von UCP1 und UCP3 beteiligt sind. Die UCP3 Inhibierung hängt ausschließlich von der R184-Phosphat Interaktion ab. R88 und weitere, noch nicht identifizierte Aminosäuren verringern die IC50 der UCP3-PN Interaktion. Des Weiteren haben wir das anorganische Phosphat als einen neuartigen Inhibitor von UCP1 und UCP3 identifiziert, der unabhängig von PN wirkt. Die kritische Analyse der Resultate beider Methoden erlaubte uns, den bekannten Mechanismus der UCP1-Inhibierung zu aktualisieren und den Mechanismus für die UCP3- Inhibierung zum ersten Mal vorzuschlagen. Wir zeigen, dass trotz ihrer hohen Homologie UCP1 und UCP3 signifikante Unterschiede in der Regulation durch Purinnukleotide aufweisen. Es ist wahrscheinlich, dass UCP3, das mit UCP1 in BAT vorhanden ist, eine andere Funktion, parallel oder ergänzend zu UCP1, hat. Die Ergebnisse sind ein wichtiger Schritt, um die Voraussetzungen für neue pharmakologische Ansätze im Kampf gegen die oben erwähnten Krankheiten zu schaffen.