Transmembrandomänen in Flavivirus-Eintritt und Assembly

Das Eindringen lipid-umhüllter Viren in eine Wirtszelle erfordert die Fusion der viralen mit einer zellulären Membran, wodurch das virale Genom in das Zellinnere freigesetzt wird. Diese Fusion wird durch in der viralen Lipidmembran verankerte Proteine vermittelt (Fusionsproteine), die - ausgelöst durch einen spezifischen "Trigger" - Konformationsänderungen durchlaufen und dadurch die Verschmelzung der beiden Membranen bewirken. Studien mit allen drei strukturellen Klassen viraler Fusionsproteine haben gezeigt, dass deren Transmembran- Domänen (TMD) in verschiedene Schritte des viralen Lebenszyklus involviert sind (u.a. auch bei der Membranfusion), aber die zu Grunde liegenden Mechanismen sind weitgehend ungeklärt. Das Klasse II Fusionsprotein E der Flaviviren ist das einzige bekannte virale Fusionsprotein mit einem doppelten Membrananker, der aus zwei antiparallel angeordneten Transmembran (TM)-Helices besteht. Beide TM-Regionen üben wichtige Funktionen in der Biosynthese und dem Prozessieren des viralen Polyproteins aus. Während des Zusammenbaus ("Assembly") der Viruspartikel interagiert das E Protein mit einem zweiten viralen Hüllprotein (prM), das einen ähnlichen doppelten Membrananker besitzt. Im Rahmen dieses Projekts wollen wir die Wechselwirkungen zwischen den bei Flaviviren einzigartigen TM- Regionen von E und prM sowohl beim Assembly als auch bei der Fusion untersuchen. Als Modell verwenden wir das durch Zecken übertragene Frühsommermeningo-enzephalitis (FSME) Virus, das gemeinsam mit den durch Stechmücken übertragenen Gelbfieber, Dengue, Japanische Enzephalitis und West Nil Viren zu den wichtigsten human-pathogenen Flaviviren zählt. Die atomaren Strukturen löslicher Formen des E Proteins von verschiedenen Flaviviren sind in ihrer Prä- und Post-Fusions-Konformation aufgeklärt worden. Diesen Strukturen fehlt allerdings der Membrananker, der in dieser Studie näher analysiert werden soll. Unter Verwendung des infektiösen Klons des FSME Virus werden wir die TM-Regionen von prM und E durch die homologen Elemente des verwandten Japanischen Enzephalitis Virus in verschiedenen Kombinationen ersetzen. Dieser Ansatz sollte eine Untersuchung von Membrananker-Interaktionen erlauben, die für die Fusion und das Assembly von Flaviviren wichtig sind, ohne die Funktionen der TMD während des Prozessierens des viralen Polyproteins zu beeinträchtigen. Zusätzliche Informationen über TMD Wechselwirkungen sollen durch das Passagieren ausgewählter Mutanten und die Identifizierung kompensatorischer Mutationen gewonnen werden. Es ist zu erwarten, dass die in dieser Studie erzielten Resultate neue Erkenntnisse über die komplexen molekularen Mechanismen des Flavivirus Assembly und der Membranfusion liefern, die auch für das spezifische Design von antiviralen Agentien gegen Flaviviren (die derzeit nicht verfügbar sind) von Bedeutung sein können.

Zu den Flaviviren zählen mehr als 70 verschiedene Viren, von denen viele humane Krankheitserreger sind, die in verschiedenen Teilen der Welt stark die öffentliche Gesundheit betreffen. Zu den wichtigsten human-pathogenen Vertretern gehören die durch Stechmücken übertragenen Dengue-, Zika-, Gelbfieber, West Nil und Japanische Enzephalitis Viren sowie das durch Zecken übertragene Frühsommermeningoenzephalitis (FSME)-Virus. Im Rahmen dieses Projekts verwendeten wir das FSME-Virus für unsere Studien und untersuchten wie die Viruspartikel in der Zelle zusammengebaut werden (Assembly) und wie sie ihre Infektiosität erlangen (Virusreifung).Flaviviren besitzen eine von der Wirtszelle abstammende Lipid?Membran, in die zwei virale Proteine integriert sind, sogenannte Hüllproteine. Diese Membran umgibt eine Proteinschale (Kapsid), die das virale Genom enthält. Es ist noch unklar wie das Kapsid während des Virus-Assemblys in infektiöse Viren verpackt wird. In unserer Arbeit konnten wir zeigen, dass Interaktionen von jenen Domänen, die die Hüllproteine in der Membran (Transmembrandomänen) verankern, für das Assembly von Viruspartikeln essentiell sind. Störungen von Wechselwirkungen der Transmembrandomänen führten vorwiegend zu einer Freisetzung von nicht?infektiösen, subviralen Partikeln ohne Kapsid zu Lasten von vollständigen Viruspartikeln. Zusätzlich zur Rolle der Transmembrandomänen im Virus-Assembly konnten wir auch eine Beteiligung dieser Strukturelemente am Reifungsprozess der Viren nachweisen.Unsere Arbeiten leisteten daher einen wichtigen Beitrag zur Aufklärung verschiedener Schritte des Lebenszyklus von Flavivren. Ein besseres Verständnis von Flavivirus?Infektionen auf zellulärer Ebene kann auch bei der Entwicklung von antiviralen Substanzen helfen, die derzeit für diese weltweit verbreiteten Krankheitserreger nicht verfügbar sind.