Kontrolle des programmierten Zelltods durch SHARPIN

Hintergrund: Ubiquitin ist ein ubiquitär exprimiertes kleines Protein, das kovalent an Substrate konjugiert wird. Wir haben gezeigt, dass SHARPIN eine zentral wichtige Untereinheiten des LUBAC (Linear Ubiquitin Chain Assembly) Komplexes ist. LUBAC synthetisiert eine neuartige Form von linearen Ubiquitin-Ketten und ist essentiell für die TNF-alpha-induzierte Aktivierung von NF-kappaB. Ubiquitin kann zu Ketten mit unterschiedlicher Topologie konjugiert werden, wodurch unterschiedliche zelluläre Signale vermittelt werden. Es ist daher entscheidend, den molekularen Mechanismus der Ubiquitinierung in einem spezifischen biologischen Kontext zu erforschen. Ein Fehlen von SHARPIN im Mausmodell führt zu massiven entzündlichen Reaktionen in diversen Organen, deren Ursache bislang völlig unbekannt ist. Interessanterweise ist die Apoptose in Keratinozyten der SHARPIN knock-out Mäuse signifikant hochreguliert und erste Daten zeigen, dass SHARPIN eine Rolle in der Nekroptose, einer weiteren Form des programmierten Zelltods spielt. Die Regulation von SHARPIN und Bedeutung linearer Ubiquitin Ketten im Rahmen von programmiertem Zelltod und Inflammation sind derzeit gänzlich unbekannt. Ziel: Das Hauptziel des Projektes besteht darin, den Mechanismus des programmierten Zelltodes durch SHARPIN- abhängige lineare Ubiquitinierung aufzuklären. Experimenteller Plan: Wir werden die Rolle von SHARPIN in den Signalkaskaden der Apoptose (Ziel1) und Nekroptose (Ziel2) klären. Dazu werden Primärzellen aus SHARPIN knock-out Mäusen verwendet. Die Signalwege des Zelltods werden mittels bekannter Stimuli, wie TNF-alpha, TRAIL und Fas-L in SHARPIN- defizienten Zellen und anhand von Apoptose und Nekroptose Markern untersucht. Die Substrate von SHARPIN werden anhand von in vitro Ubiquitinierungsassays und Massenspektrometrie analysiert. Weiterhin wollen wir definieren, ob das Fehlen von SHARPIN einen Effekt auf die Bildung des "Zelltodkomplexes" hat. Wir werden aufklären, ob die Entzündungen der Haut in SHARPIN knock-out Mäusen durch Apoptose oder Nekroptose verursacht ist, indem wir genetisch TRADD oder RIP3 ausschalten, die bei bestehender SHARPIN Defizienz für Apoptose oder Nekroptose essentiell sind (Ziel3). Der inflammatorische Phänotyp wird histologisch und anhand von Proliferationsmarkern für Keratinozyten untersucht werden. Primäre Keratinozyten dieser knock-out Mäuse werden mit TNF-alpha stimuliert um die Signaleffekte zu charakterisiert. Signifikanz: Dieses Projekt wird erstmalig die SHARPIN-induzierte linearen Ubiquitinierung und Aktivierung des programmierten Zelltods untersuchen und die Verbindung zu inflammatorischen Prozessen definieren. Dies hat weitreichende Implikationen für das Verständnis diverser Pathologien.

Ubiquitin ist ein Protein, das wesentlich den Gesundheitszustand eines Menschen reguliert, und in viele Erkrankungen wie Entzündungen und Krebs involviert. Ubiquitin beeinflusst solche Erkrankungen durch die Modifikation von Proteinen, welche wichtig für die Regulation ebendieser sind. Es ist bekannt, dass eine Reihe von Enzymen dabei Schlüsselrollen übernehmen. Bisher waren wir und andere in der Lage einen spezifischen Ubiquitin-Enzym-Komplex, namens Linear UBiqutin chain Assembly Complex (LUBAC) bestehend aus den drei Proteinen SHARPIN, HOIP und HOIL-1L, zu identifizieren, welcher Entzündungsantworten reguliert. Mit Hilfe dieser Forschungsförderung konnten wir aufzeigen, dass ein Sharpin- Defizit in Mäusen zu schweren Hautentzündungen mit einhergehender Steigerung von Zelltod in Keratinozyten führt und dass der Hautphänotyp in diesen Mäusen von Tumor Necrosis Factor (TNF)- und TRADD-mediierten Apoptose abhängig ist (Kumari et al., 2014). Während dieser Forschungsstudie konnten wir zeigen, dass nicht nur SHARPIN sondern auch HOIL-1L und HOIP entscheidende Rollen bei der Regulation von Zelltod in Keratinozyten haben. Daher ist es unabdingbar zu verstehen wie LUBAC als Komplex Entzündungsantworten reguliert. Zumal HOIL-1L in Autoimmunerkrankungen des Menschen involviert ist und neuste Studien zeigen konnten, dass HOIL-1L für Entwicklung und Regulierung von Zelltod in Mäusen (Peltzer et al. 2018, Fujita et al. 2018) essentiell ist, wird deutlich wie bedeutsam ein detaillierteres Verständnis der Regulationsfunktion von HOIL-1L in Hinsicht auf Entzündungen ist. Um die Fragestellung, wie LUBAC-Proteine Entzündungen und Zelltod regulieren, genauer zu untersuchen, haben wir mittels geneditierender CRISPR-Cas9-Technologie neue Mauslinien, welche Genmutation der einzelnen LUBAC-Komponenten aufweisen, etabliert. Zurzeit analysieren wir einerseits mit histologischer Analysen die Bedeutung dieser Mutationen in Mäusen, und andererseits mittels Untersuchung primärer Fibroblasten und Makrophagen aus dem Knochenmark die Auswirkungen auf zellulärer Ebene. Mit Hilfe dieser neu generierten Mauslinien und vorhandener Erforschung von SHARPIN (Kumari et al., 2014), haben wir das Forschungsziel die Rolle der einzelnen LUBAC-Komponenten bei der Regulierung von Apoptose und Entzündung in vivo (ein Manuskript ist in Vorbereitung) weiter zu untersuchen. Wir erwarten, dass unsere Forschungsstudien einen wesentlichen Beitrag zum Verständnis menschlicher Erkrankungsmechanismen leisten werden, und aufgrund unseres Fokus auf die Rolle des spezifischen Ubiquitin Komplex LUBAC besonders hinsichtlich menschlicher Autoimmunerkrankungen.