Aussenmembranvesikel von Gram-negativen Erregern des Gastrointestinaltrakts

Außenmembranvesikel (OMVs) sind natürliche Abschnürungen der Zelloberfläche von Gram-negativen Bakterien. Aufgrund Ihrer Entstehung sind OMVs nicht-lebende Faksimiles der Bakterien, welche eine Vielzahl an immunogenen, nativen Oberflächenantigenen tragen und somit interessante Vakzinkandidaten darstellen. In drei kürzlich veröffentlichten Studien konnten wir zeigen, dass OMVs aus dem humanen Krankheitserreger Vibrio cholerae effektive und stabile Cholera-Impfstoff-Kandidaten sind. In der ersten Aktivität dieses Antrags wollen wir den Cholera-Impfstoff auf der Basis von OMVs verbessern und näher charakterisieren. Dies beinhaltet die Reduzierung der Endotoxizität durch genetische Modifikation des Lipid A-Komplexes. Dadurch werden ungünstige Nebenwirkungen minimiert und das Spektrum der möglichen Applikationswege auch auf subkutane und intramuskuläre Injektionen erweitert, welche für andere Vakzine häufig verwendet werden. Die Identifizierung der protektiven Antigen wird nicht nur die wichtigen immunogenen Bestandteile der OMVs aufzeigen, sondern möglicherweise auch ein gemeinsames Prinzip der Protektion aller Cholera-Impfstoffe aufdecken, welches auf der Hemmung der Motilität von V. cholerae beruht. Immunisierungsstudien mit Antigenen von enterotoxischen Escherichia coli (ETEC) werden zeigen, ob diese Protektionsmechanismen auch für andere Erreger gelten. Darüber hinaus möchten wir einen kombinierten Impfstoff gegen die zwei wichtigsten bakteriellen Erreger von Durchfallerkrankungen, V. cholerae und ETEC, entwickeln. Alle Ziele dieser ersten Aktivität können unabhängig erreicht werden, aber im Erfolgsfall synergistisch zu einem verbesserten OMV-Impfstoffkandidaten beitragen. In der zweiten Aktivität dieses Antrags werden wir die OMV-Biogenese unter Verwendung von V. cholerae als Modellorganismus näher untersuchen. Mehrere Modelle für Vesikelbildung wurden vorgeschlagen, jedoch gibt es wenig Beweise für diese Mechanismen und unser Wissen über ihre biologische Funktion und den Abschnürungsprozess sind sehr begrenzt. Vorläufige Ergebnisse unserer Arbeitsgruppe belegen, dass die Zusammensetzung der V. cholerae OMVs durch veränderte Umweltreize (z.B.: während der Induktion von Virulenz-Genen) oder Mutationen in der LPS-Biosynthese verändert wird. Daher wollen wir mehr über die Zusammensetzung der V. cholerae OMVs lernen und die Regulation der Biogensese lernen. Unter Verwendung einer Transposon-Mutagenese wollen wir Mechanismen der OMV-Biogenese entdecken und charakterisieren. Durch die Kooperation mit Laboratorien von G. Daum und M. Feldman wird die notwendige Expertise ind Infrastruktur zur detaillierten Lipid-, Protein- und LPS-Analyse bereitgestellt. Zusammenfassend sollen die Ergebnisse des geplanten Projekts unser Verständnis über die Immunantwort durch Immunisierung mit OMVs verbessern, das Spektrum für den Einsatz von OMVs als Impfstoff-Kandidaten erweitern und zelluläre Mechanismen aufdecken, welche bei der OMV-Sekretion und Sortierung der OMV-Inhalte beteiligt sind.

Außenmembranvesikel (OMVs) sind natürliche Abschnürungen der Zelloberfläche von Gram-negativen Bakterien. Aufgrund Ihrer Entstehung sind OMVs nicht-lebende Faksimiles der Bakterien, welche eine Vielzahl an immunogenen, nativen Oberflächenantigenen tragen und somit interessante Vakzinkandidaten darstellen. In Pilotstudien vor diesem Projekt konnten wir bereits zeigen, dass OMVs aus dem humanen Krankheitserreger Vibrio cholerae effektive und stabile Cholera-Impfstoff-Kandidaten sind. Im Rahmen der ersten Aktivität des Projekts haben wir den Cholera-Impfstoff auf der Basis von OMVs verbessert und näher charakterisiert. Dies beinhaltete die Reduzierung der Endotoxizität durch genetische Modifikation des Lipid A-Komplexes. Dadurch werden ungünstige Nebenwirkungen minimiert und das Spektrum der möglichen Applikationswege auch auf subkutane und intramuskuläre Injektionen erweitert, welche für andere Vakzine häufig verwendet werden. Weiterhin wurde das O-Antigen als protektives Antigen und somit wichtigen immunogenen Bestandteil der OMVs identifiziert. Dadurch konnte auch ein gemeinsames Prinzip der Protektion aller Cholera-Impfstoffe aufdeckt werden, welches auf der Hemmung der Motilität von V. cholerae beruht. Entlang unserer Studien wurde der bestehen OMV-Impfstoffkandidat auch auf enterotoxische Escherichia coli (ETEC) erweitert. Dies erlaubte die Entwicklung eines kombinierten Impfstoffs gegen die zwei wichtigsten bakteriellen Erreger von Durchfallerkrankungen, V. cholerae und ETEC. In der zweiten Aktivität des Projekts wurde die OMV-Biogenese von Gram-negativen Bakterien erforscht. Durch eine breit angelegte Transposon-mutagenese wurde ein über alle Gram-negativen Bakterien konservierter retrograder Phospholipidtransporter identifiziert, wessen Aktivität entscheidend zur Biogenese von Aussenmembranvesikel beiträgt. Ein Abschalten des retrograden Phospholipidtransporters bewirkt eine Akkumulation von Phospholipiden in der Aussenmembran und erhöht die Abschnürung von Aussenmembranvesikel. Weiterhin wurde Eisenmangel als Signal für das Abschalten des retrograden Phospholipidtransporters und damiterhöhteProduktionvon Aussenmembranvesikel identifziert. Damit haben die Bakterien die Möglichkeit, die Vesikelmenge zu steuern. Zusammenfassend haben die Ergebnisse des Projekts unser Verständnis über die Immunantwort durch Immunisierung mit OMVs verbessert, das Spektrum für den Einsatz von OMVs als Impfstoff-Kandidaten erweitert und einen grundlegenden Mechanismus zur OMV- Biogenese aufgedeckt.