Einzelmolekül-Plattform für Protein Interaktions Analysen

Die Plasmamembran von T Zellen beinhaltet eine Vielzahl von Protein-Komplexen, die wichtige regulatorische Aufgaben erfüllen. Während der Zellaktivierung ändern solche Komplexe die Zusammensetzung, indem sie miteinander fusionieren, sich trennen, oder weitere Proteine anziehen. Das vielleicht wichtigste Beispiel ist der T Zell Rezeptor (TCR) Komplex, in dem die TCR a- und ß-Kette stabil mit CD3, CD3d, CD3e oder CD3 verbunden sind, oder transient mit z.B. Lck, CD2, LAT, oder ZAP-70. Ein zweites Beispiel aus der T Zell Biologie ist der Korezeptor CD4, welcher die Kinase Lck an den TCR rekrutiert, wodurch Tyrosinreste am TCR phoshoryliert werden können. In beiden Beispielen gibt es für die stöchiometrische Zusammensetzungen und deren Variabilität nur vage Indizien. Mit gegenwärtigen Techniken ist es generell schwierig, quantitative Informationen über die hetero-oligomere Zusammensetzung von Proteinkomplexen zu erhalten. In dem vorliegenden Projekt werden wir diesen Bedarf direkt adressieren, indem wir eine neuartige, Mikroskopie-basierte Plattform zur quantitativen Messung an einzelnen Proteinkomplexen direkt in der zellulären Plasmamembran entwickeln. Die neue Methode wird modernste Verfahren zur Nanostrukturierung von Oberflächen bzw. zur Abbildung einzelner Biomoleküle kombinieren. Sie geht zurück auf eine von uns entwickelten Technik zur Untersuchung von Protein-Interaktionen in der lebenden Zellmembran mittels Mikrostrukturierung. Wir nutzen dabei das Köder-Beute-Prinzip aus. Ein Ligand, welcher spezifisch das Köder-Molekül in der Zellmembran bindet, wird entlang eines charakteristischen Musters auf einer Glasoberfläche immobilisiert. Lässt man Zellen auf solchen Oberflächen anwachsen, so ordnen sie das Köder-Molekül entlang des Musters an. Interaktionen zwischen dem Köder und einem fluoreszenzmarkierten Beute-Molekül führen zu einer Umverteilung des Beute-Moleküls entlang der gleichen Muster. Wir möchten in diesem Projekt die mikrostrukturierten Plattformen in den Nanometer-Bereich erweitern und mit einzelmolekularer Mikroskopie kombinieren. Unsere Idee ist es, kombinierte mikro- und nanostrukturierte Oberflächen zu entwickeln, welche einen Antikörper in einem charakteristischen Muster präsentieren, um das Köder-Molekül welches Teil des zu untersuchenden Proteinkomplexes ist zu fangen. Wenn Zellen auf solchen Oberflächen wachsen, werden die Ködermoleküle und damit die Proteinkomplexe entlang der Nanostrukturen immobilisiert. Kombinierte Mikro- und Nanostrukturen werden entworfen, um Analysebereiche zu bilden, in denen die Proteinkomplexe auf 50nm Punkten mit einem Abstand von 1m angeordnet werden. Wir werden Einzelmolekülmikroskopie zum Abzählen der in einem Komplex kolokalisierten Proteinmoleküle verwenden. Außerhalb des Analysebereichs werden die Mikrostrukturen werden mit einer hohen Dichte an Fänger-Antikörper belegt, um den Überschuss an Köder-Molekülen vom Analysebereich zu separieren. Ein Teil des Projektes ist die Entwicklung der neuen Plattformen. Weiters werden einzelmolekulare Mikroskopieverfahren als Auslesemethoden für den zweiten Projektteil verwendet, in dem die neue Plattform zur Charakterisierung von Proteinkomplexen in der T Zellmembran eingesetzt wird.

Die zelluläre Plasmamembran enthält eine Vielzahl von Proteinkomplexen, die wichtige Regulatoren der Zellfunktion sind. Während der Zellaktivierung verändern einige Komplexe ihre Zusammensetzung, indem sie fusionieren, segregieren oder zusätzliche Proteine rekrutieren. In diesem Projekt wollten wir neue innovative Methoden zur quantitativen Analyse der molekularen Organisation direkt in der Plasmamembran entwickeln, ohne dass biochemische Reinigungsschritte erforderlich wären. Unsere Idee war, Membranproteine in der Plasmamembran einzufangen und zu immobilisieren, indem wir Zellen auf mikro- und nanostrukturierten Oberflächen, die mit einem spezifischen Liganden gegen ein Protein von Interesse dekoriert sind, wachsen lassen. Mittels Fluoreszenzmikroskopie wollten wir als nächstes die Rekrutierung anderer Plasmamembranproteine und -lipide quantifizieren. Unser ultimatives Ziel war es, einzelne Moleküle mit dieser Methode zu fangen. Wir analysierten zunächst die Rolle von Lipiden für die Interaktion von Plasmamembranproteinen. Lange Zeit wurde geglaubt, dass Lipide nanoskopische, hochdynamische Einheiten in der zellulären Plasmamembran bilden können, die als Lipid Rafts bezeichnet werden, und von denen angenommen wurde, dass sie für Proteininteraktionen bedeutend sind. Mit Hilfe der Micropatterning-Technik konnten wir jedoch das Vorhandensein solcher Rafts in der lokalen Umgebung von speziellen lipidverankerten Proteinen, die als archetypische Marker von Rafts angesehen werden, ausschließen. Insbesondere waren wir daran interessiert, Proteinkomplexe in der T-Zell-Plasmamembran zu verstehen. Neuartige hochaufgelöste mikroskopische Studien zeigten, dass eine Vielzahl von Proteinen - einschließlich des T-Zell-Rezeptors - in nanometergroßen Domänen organisiert sind, die bei Aktivierung größer werden. Wir fanden jedoch heraus, dass die Analyse von solchen hochaufgelösten Bildern sehr anfällig für Artefakte ist, und zur Detektion von falschen Molekülclustern führen kann. Um dieses Problem zu lösen, haben wir eine neue Technik entwickelt, die eine artefaktfreie Analyse von hochaufgelösten Mikroskopiedaten ermöglicht. Mit dieser Technik konnten wir substantielles Nanoclustering des T-Zell-Rezeptors und einer Vielzahl anderer Signalproteine in nicht-aktivierten T-Zellen ausschließen. Schließlich wollten wir den Mikrostrukturierungsansatz miniaturisieren. Zu diesem Zweck haben wir mittels Elektronenstrahllithographie Kohlenstoffpunkte auf Glasdeckgläsern abgeschieden. In einem zweiten Schritt wurden DNA-Nanostrukturen spezifisch an diese Inseln gebunden. Weiters gelang es uns, DNA-Hybridisierung zu verwenden, um die Punkte mit einer genau definierten Anzahl von Biomolekülen spezifisch zu dekorieren, wodurch eine nanostrukturierte Oberfläche für zellbiologische Anwendungen bereitgestellt wird.