Entstehung und Rolle von ILEI Dimeren in Krebsprogression

Ziel dieses Antrages ist die Aufklärung zellulärer und molekularer Mechanismen, die für die Regulierung der ILEI Aktivität verantwortlich sind. Unser Schwerpunkt liegt an der mechanistischen Charakterisierung der Disulfidbrücken-vermittelten Dimerbildung, deren Rolle in der Funktion des Proteins und deren Einzigartigkeit unter anderen ILEI-ähnlichen Molekülen. ILEI ist ein an der Krebsentwicklung und Progression zentral beteiligtes Cytokin. Es ist eine Mitglied der stark homologen FAM3 Familie von Cytokinen. Es ist ein fakultativ sezerniertes Protein wobei für die Regulierung der Sekretion das Plasminogen-uPAR System entscheidend ist. Die Existenz eines fünften Cysteins in der Peptidsequenz von ILEI ist einzigartig in der FAM3 Familie. Dieses Cystein ist notwendig für die Dimerisierung des Moleküls. Dadurch existiert ILEI gleichzeitig sowohl intra- als auch extrazellulär als Monomer und Dimer, welche durch intra- bzw. intermolekulare Disulfidbrücken stabilisiert werden. Unser Ziel ist die Validierung und Identifizierung der für die Dimerbildung verantwortlichen, extrazellulären Protein Disulfid Isomerase (PDI) Aktivität. Diese Studien werden durch die Anwendung von Inhibitor- und in vitro PDI Aktivitätsassays durchgeführt. Weiters werden wir in vitro in biochemischen Assays mittels aufgereinigtem ILEI Protein und mittels Zellen mit transienter oder stabiler Überexpression von wildtyp und mutanten ILEI Formen die Reversibilität der Dimerisierung sowie den Einfluss des ILEI Propeptids auf die Dimerisierung analysieren. Dadurch werden wir Mechanismen identifizieren, welche das Gleichgewicht der Dimerbildung regulieren. Über Mutationsanalyse anderer Mitglieder der FAM3 Familie werden wir testen, ob das Vorhandensein des fünften Cysteins die einzige Voraussetzung für die Bildung Disulfid-vermittelter Dimere in der "four-helix-bundle" sekundären Struktur der FAM3 Familie ist und in wie weit solche Dimere die Funktion von ILEI übernehmen können. Zusätzlich werden wir analysieren, ob die basale oder die durch Plasmin induzierte Sekretion von ILEI eine Preferenz für bestimmte Folding-Formen des Moleküls aufweist. Dies wird durch die Bestimmung des Mengenverhältnisses sezernierter ILEI Monomere und Dimere vor und nach Plasmin Induktion analysiert. Um die Wichtigkeit der Dimerisierung in der Funktion von ILEI als Tumorpromoter und Promoter von epithelialer- zu-mesenchymaler Transition (EMT) zu analysieren, werden wir vorläufige Ergebnisse, welche auf die Notwendigkeit der Dimerisierung hinweisen, verifizieren und Tumorbildungs- sowie Lungenkolonisationsassays mit Tumorzellinien, welche Dimerisierungsmutanten von ILEI überexprimieren, durchführen und diese Zellinien in vitro für ihre Invasions- und EMT-Fähigkeiten charakterisieren. Weiters werden wir die Abhängigkeit der ILEI Funktion von der identifizierten PDI Enzymaktivität in vitro und in vivo mittels RNA Interferenz und Inhibitoren analysieren. Abschließend werden wir die PDI-Expression in klinischen Proben von Krebspatienten mit deren Überlebensraten korrelieren, um die Relevanz des identifizierten PDIs als ein potentielles neues therapeutisches Target zu ermitteln.

ILEI ist ein von Zellen ausgeschüttetes Molekül, welches zentral an der Krebsprogression und Metastasierung beteiligt ist. Ziel dieser Arbeit war die Aufklärung struktureller Voraussetzungen der Aktivität des ILEI Proteins, mit Fokus auf Dimerbildung, deren Rolle in der Funktion des Proteins und deren Einzigartigkeit unter anderen ILEI-ähnlichen Molekülen. Die wichtigste Erkenntnis dieser Arbeit ist, daß ILEI Dimerbildung essentiell für die Krebsprogression und Metastasierung ist. Weiters identifiziert diese Studie für ILEI einzigartige oder teilweise in anderen ILEI-ähnlichen Molekülen vorhandene strukturelle Elemente, die für die Dimerbildung und für die Funktion von ILEI notwendig und ausreichend sind. Zusätzlich werden hier neue Moleküle identifiziert, welche die Dimerbildung und dadurch die Aktivität dieses sezernierten Proteins regulieren. Diese Erkenntnisse über Regulation von ILEI Aktivität durch Dimerbildung sind hoch relevant nicht nur für die Krebsforschung, sondern auch für die Erforschung anderer Krankheiten, in welchen die Beteiligung von ILEI beschrieben worden ist, z.B. Alzheimer-Demenz, Diabetes, nicht-alkoholische Fettleber Krankheit und Knochendichte Fehlregulierungen, u.a. Osteoporose. Da alle dieser Krankheiten weltweit ernste Probleme für das Gesundheitswesen darstellen und zu den häufigsten Krankheiten der alternden westlichen Gesellschaft gehören, ist es dringend notwendig, ihre molekularen Ursachen und Krankheitsabläufe besser zu verstehen, um neue Angriffspunkte für zukünftige pharmazeutische Wirkstoffe zu identifizieren und wirksame und leistbare Medikamente und Therapien zu entwickeln. Die neuen Erkenntnisse in der Funktion von ILEI werden zu diesen Bestrebungen beitragen, weil sie neue potentielle therapeutische Targetmoleküle und Angehensweisen entziffern.