Analyse der Rolle der PRK1 in der Neuroprotektion

Während des letzten Jahrzehntes lag der Forschungsschwerpunkt meines Labors in der Analyse von Adenosin Rezeptor- bzw. von Purinnukleosid-vermittelten zellulären Signaltransduktionswegen in hypoxischen Neuronen. Das Ziel des vorgelegten Projektvorhabens besteht in der vertieften Analyse der Kandidatenfunktion von vorselektionierter PRK1 als direkter Signalschalter in Purinnukleosid-vermittelten Schutzmechanismen von hypoxischen neuronalen Zellen. Rationale Basis: Unsere Gruppe identifizierte kürzlich eine Kandidatenrolle für die Proteinkinase C-verwandte Kinase 1 (PRK1; auch bekannt als PKN1 unter anderen Synonymen) in der Regulation von neuroprotektiven Prozessen. Unsere Schlüsselbefunde sind: 1) Neurotrophe Faktoren und Hypoxie regulieren die Aktivität von PRK1. PRKdefiziente neuronale Zellen zeigen 2) einen Verlust von Viabilität, Neuritenbildung und Integrität des Zytoskeletts und 3) können nicht mehr durch neurotrophe Faktoren geschützt werden. In Summe weisen die Resultate auf eine potentiell kritische Rolle der PRK1 in neuroprotektiven Prozessen hin. Trotzdem, sind sowohl die Rolle der PRK1, wie auch die präzisen PRK1-assoziierten molekularen Mechanismen in der Schutzfunktion von Neuronen noch unbekannt. Hauptziele des Forschungsprojekts: Neuroprotektion und Neuroregeneration sind zwei mögliche therapeutische Ansätze um die Zerstörung von Neuronen beim Schlaganfall abzuschwächen. Zunehmende Befunde weisen darauf hin, dass Purinnukleoside als trophische Faktoren im hypoxischen Gehirn wirken könnten. Basierend auf unseren kürzlich erhobenen experimentellen Resultaten haben wir eine Funktion der PRK1 in der Regulation von Purinnukleosidvermittelten Rettungsmechanismen von neuronalen Zellen feststellen können. Um unsere Resultate zu validieren, und um die Upstream` und Downstream` Signalmechanismen dieses PRK1-mediierten Kandidatenwegs in hypoxischen neuronalen Zellen zu erschließen, schlage ich die Untersuchung folgender Kernfragen vor: Als Ziel 1, und basierend auf unseren präliminieren Resultaten, werden wir die Upstream-Regulation` der PRK1 durch Adenosinrezeptoren und die kleinen G-Proteine RhoA und Rac1 in neuronalen Zellen analysieren. Als Ziel 2 werden wir uns der Downstream` Effektor Moleküle der PRK1 mit besonderem Augenmerk auf die PRK1-vermittelte Transaktivierung des Plastizitätsproteins GAP-43 zuwenden. Als Ziel 3 wird die Notwendigkeit der Funktion von PRK1 und potentiell auch von PRK2 für die Neuroprotektion von hypoxischen Neuronen in Knockout-mäusen` adressiert werden. Als 4.Ziel soll ein in vivo Schlaganfallmodel in PRK Knockoutmäusen`, eine Pionierarbeit für unseren wissenschaftlichen Standort, etabliert werden. Die Nutzung von genetischen Mausmodellen in Kombination mit Techniken aus Biochemie, siRNA-vermittelten Knockdown und Zellbiologie soll neue Forschungswege erschließen, die einen innovativen Ansatz, zur Erforschung der Rolle und der molekularen Mechanismen der PRK1 in Purinnukleosid-vermittelter Protektion von hypoxischen Neuronen, darstellen.

Unsere Untersuchungen der Adenosin Rezeptor/Purinnukleosid-Signalkaskade in Hypoxie/ Ischämie (1-3) legten eine Verknüpfung mit der Serin/Threonin Proteinkinase N (PRK/PKN) (4, 5) nahe. PKN1 wird im Gehirn stark exprimiert, über ihre Funktion in Neuronen war bisher jedoch wenig bekannt. Im Rahmen des FWF-Projekts untersuchten wir die Rolle und Regulierung der PKN1. Wir identifizieren PKN1 als Torwächter der neuronalen AKT-Aktivität und zeigen die in vivo-Bedeutung dieser Wechselwirkung während der Entwicklung des Nervensystems. Unsere Ergebnisse zeigen, dass PKN1- Expression und AKT- Phosphorylierung während kritischer Entwicklungsstadien der axo-dendritischen Reifung im Kleinhirn umgekehrt korreliert sind. Das Ausschalten von PKN1 führt zu hyperaktiver AKT, was zu dickeren Purkinje-Zelldendriten und einer defekten Kletter-/Parallel-Faser- Homöostase führt. Dies wiederum führt bei erwachsenen Tieren zu einer Kleinhirnschrumpfung und einem Ataxie-artigen motorischen Phänotyp. Unsere Arbeit etablierte damit PKN1 als einen überzeugenden neuen Kandidaten für Studien von Pathologien des humanen Gehirns (6). _______________________ 1.Thauerer B, zur Nedden S, and Baier-Bitterlich G. Vital role of protein kinase C-related kinase in the formation and stability of neurites during hypoxia. J Neurochem. 2010;113(2):432-46. 2.zur Nedden S, Tomaselli B, and Baier-Bitterlich G. HIF-1 alpha is an essential effector for purine nucleoside-mediated neuroprotection against hypoxia in PC12 cells and primary cerebellar granule neurons. Journal of neurochemistry. 2008;105(5):1901-14. 3.Tomaselli B, Nedden SZ, Podhraski V, and Baier-Bitterlich G. p42/44 MAPK is an essential effector for purine nucleoside-mediated neuroprotection of hypoxic PC12 cells and primary cerebellar granule neurons. Mol Cell Neurosci. 2008;38(4):559-68. 4.Mukai H. The structure and function of PKN, a protein kinase having a catalytic domain homologous to that of PKC. J Biochem (Tokyo). 2003;133(1):17-27. 5.Quetier I, Marshall JJ, Spencer-Dene B, Lachmann S, Casamassima A, Franco C, et al. Knockout of the PKN Family of Rho Effector Kinases Reveals a Non-redundant Role for PKN2 in Developmental Mesoderm Expansion. Cell Rep. 2016. 6.zur Nedden S, Eith R, Schwarzer C, Zanetti L, Seitter H, Fresser F, et al. Protein kinase N1 critically regulates cerebellar development and long-term function. J Clin Invest. 2018;128(5):2076-88.