Metabolismus von T-2 und HT-2 Toxin in Weizen, Gerste und Hafer

T2 Toxin (T2) und HT2 Toxin (HT2) gehören zu den Typ A-Trichothecenen und werden von Fusarium sporotrichioides, F. langsethiae und F. poae nach Befall von Hafer, Gerste und Weizen gebildet. T2 und HT2 hemmen die Proteinbiosynthese und sind somit von großer Relevanz für die menschliche Gesundheit. Für die Summe der beiden Toxine wurde ein provisorischer TDI-Wert von 0.06 Mikrogr/kg festgelegt. In der EU werden derzeit auch Grenzwerte in für die menschliche Ernährung bestimmtem Getreide vorbereitet. Für die Abschätzung des von den beiden Toxinen ausgehenden Risikos für die Ernährungssicherheit muss die Metabolisierung der beiden Toxine durch Fusarienbefallene Pflanzen beachtet werden. Die 3-O-Glukoside von T2- and HT2 und das HT2-4-O-Glukosid wurden vor kurzem in Weizen und Hafer nachgewiesen. Eine kürzlich durchgeführte Pilotstudie zeigte, dass Weizenlinien, welche den Quantitative Trait Locus (QTL) Fhb1 beherbergen, eine höhere Toleranz gegenüber T2 und HT2 besitzen. Während seit einigen Jahren bekannt ist, dass Fhb1 die Entgiftung des Typ-B Trichothecens Deoxynivalenol (DON) durch Bildung von DON-3-O-Glukosid vermittelt, ist der Mechanismus der Entgiftung von T2/HT2 durch diesen QTL nicht untersucht worden und wird im vorliegenden Projekt genauer erforscht. Konjugate, wie beispielsweise die T2- und HT2-Glukoside stellen möglicherweise "maskierte Toxine" dar, welche durch Routinemessungen nicht erfasst werden, im Verdauungstrakt von Säugern die ursprünglichen Toxine (T2/HT2) jedoch wieder freisetzen können. Es ist auch denkbar, dass ein Teil der gebildeten Toxine in die Pflanzenmatrix eingebaut wird, woraus sie durch Chemolyse oder Extraktion möglicherweise (zumindest teilweise) wieder freigesetzt werden können. Der Kenntnisstand zur Metabolisierung von T2 und HT2 durch Pflanzen ist jedoch sehr gering. Daher sollen in diesem Projekt 1) der Verbleib von T2 und HT2 in planta aufgeklärt, 2) Methoden zum qualitativen und quantitativen Nachweis möglicher neuer Metabolite entwickelt und 3) Referenzstandards dieser (neuen) Substanzen hergestellt werden. Zum Aufspüren von T2- und HT2- Transformationsprodukten werden 1:1 Mischungen aus natürlichen und U-[ 13C]-Toxinen auf Weizen, Gerste und Hafer appliziert. Nach unterschiedlich langer Einwirkzeit werden mittels LC-hochauflösender MS sowohl nach bekannten (d.h. vorhergesagten) als auch unbekannten Stoffwechselprodukten gesucht und deren Struktur aufgeklärt. Auf ähnliche Weise wird mittels Szintillations-Messungen von 14C-markierten Toxinen untersucht wie groß der Anteil unlöslicher Toxinderivate in der Pflanzenmatrix ist. Durch Solvolyse soll der extrahierbare, Polymer-gebundene Anteil ermittelt werden um eine Gesamtbilanz des Verbleibs der applizierten Toxine abschätzen zu können. Darüber hinaus soll die Relevanz der gefundenen T2-/HT2-Toxinderivate durch deren Nachweis in Fusarium-inokuliertem Getreide bestätigt werden, bevor im Rahmen einer Pilotstudie deren Vorkommen auch in natürlich infiziertem Getreide untersucht wird. Schließlich wird der durch Fhb1 vermittelte Mechanismus der Fusarium-Resistenz unter Verwendung nahisogener Weizenlinien (mit und ohne Fhb1) untersucht. Hierzu soll die differenzielle Bildung der T2 and HT2 Metabolisierungsprodukte erforscht werden.

Die Schimmelpilzgifte T-2 Toxin (T2) und HT-2 Toxin (HT2) werden häufig in Getreide, wie z.B. Gerste, Weizen und Hafer gefunden. In einer Abwehrreaktion der betroffenen Pflanzen, werden diese Substanzen metabolisiert und dabei werden verschiedene Derivate von T2 und HT2 mit bisher größtenteils unbekannten chemischen Strukturen und toxikologischen Auswirkungen für Säugetiere gebildet. In diesem Projekt wurden umfangreiche Studien zum Metabolismus von T2 und HT2 in Getreide mittels optimierter Metabolomik-Methoden durchgeführt. Dadurch konnten zahlreiche neue T2/HT2 Biotransformationsprodukte in Gerste, Weizen und Hafer gefunden werden. Die Strukturannotierung ließ darauf schließen, dass Hydroxylierungen, Hydrolysen und Konjugationen (mit Glukose, Essigsäure, Malonsäure, Äpfelsäure und Ferulasäure) an den Transformationsprozessen beteiligt sind. Quantitative Experimente ermöglichten einen detaillierten Einblick in die Kinetik und das Ausmaß der T2/HT2 Biotransformationen. Diese Experimente zeigten, dass das Ausgangsgift T2 sehr schnell und in hohem Ausmaß zu HT2 umgewandelt wurde. Das führte zu einer weitgehenden Übereinstimmung von T2 und HT2 Biotransformationsprodukten. Der Hauptstoffwechselweg beider Typ A Trichothecene führte in allen untersuchten Pflanzenarten zur raschen Bildung von HT2-3-O-?-D-Glukosid, das darauffolgend in weitere Derivate umgewandelt und teilweise zu nicht-behandelten Pflanzenteilen transportiert wurde. Neben der Glukosylierung von HT2, konnte erstmals ein weiterer Stoffwechselweg in T2-behandeltem Getreide nachgewiesen werden, nämlich die direkte Konjugation von intaktem T2 zu T2-3-O-?-Glukosid, 3-Acetyl-T2 und Feruloyl-T2.Im Rahmen dieses Projektes wurden auch gezielt neue analytische Methoden für die Detektion, Identifizierung und Quantifizierung von T2, HT2 und deren Derivate entwickelt sowie Software-Programme (MetExtract II und MetMatch) verbessert. Diese erlauben eine verbesserte Erhebung des Vorkommens dieser Substanzen in natürlich-kontaminiertem Getreide. Das generierte Wissen und die entwickelten Methoden bilden eine wichtige Basis für die zukünftige Abschätzung des Risikos von kontaminiertem Getreide und könnten auch die Züchtung von Getreide mit höherer Resistenz gegenüber Pilzen, deren Toxine und damit verbundenen Pflanzenkrankheiten vorantreiben. Es werden jedoch noch weitere Untersuchungen der detektierten T2/HT2 Derivate bezüglich deren Toxizität, Bioverfügbarkeit für Säugetiere, Stabilität in Verdauungsprozessen, natürlichen Vorkommens, sowie Involvierung in Pflanzen-Resistenzmechanismen benötigt.